Structural and functional insights on the electrifying pathways of Geobacter sulfurreducens

Abstract

Os microorganismos electroactivos são capazes de transferir electrões para o meio extracelular, o que permite que sejam utilizados em tecnologias electroquímicas microbianas (TEM). No entanto, apesar do seu potencial, a aplicação e eficiência destas tecnologias é ainda limitada, principalmente devido aos baixos níveis de corrente produzidos. Consequentemente, é fundamental compreender os mecanismos que governam o fenómeno de transferência electrónica extracelular (TEE) de uma perspectiva estrutural e funcional, de forma a que estes processos possam ser optimizados. Geobacter sulfurreducens é uma bactéria Gram-negativa electroactiva modelo, sendo responsável pelas maiores densidades de corrente observadas em TEM. Os componentes mais relevantes das vias de TEE desta bactéria já foram identificados por estudos genómicos e proteómicos, no entanto, os mecanismos subjacentes a este processo não foram clarificados. O trabalho desenvolvido durante esta Tese resulta da aplicação de uma combinação de técnicas biofísicas e métodos computacionais que permitiram o estudo de vários componentes das vias de TEE de G. sulfurreducens. Os modelos dos complexos porina-citocromo desta bactéria foram previstos pelo AlphaFold 2, o que permitiu obter informação sobre a coordenação axial e disposição espacial dos hemos, a função, o enrolamento e a organização geral destes complexos. Esta informação serviu para definir novas estratégias de produção destas proteínas. Estudos de RMN e SAXS demonstraram que a proteína periplasmática ExtJ, parte do complexo porina-citocromo ExtHIJKL, forma homodímeros através de pontes dissulfureto intramoleculares, utilizando um resíduo de cisteína localizado no domínio flexível do C-terminal. A sua estrutura em solução indica que a proteína é homóloga a proteínas que ligam moléculas de flavina, no entanto, a proteína não interage com FMN. Previsões do AlphaFold-Multimer sugerem que a ExtJ poderá interagir com a porina ExtI. Com base nestes resultados, postula-se que o processo de dimerização possa ser controlado por mecanismos de quebra e formação de pontes dissulfureto, que por sua vez controlam a formação do complexo ExtI-ExtJ e a passagem de moléculas através desta porina. O citocromo extracelular PgcA possui uma estrutura difusa com três domínios citocromo ligados por secções desestruturadas. Estudos biofísicos dos domínios individuais e do citocromo completo demonstram que a proteína estabelece uma cadeia electrónica flexível, adoptando múltiplas conformações que promovem transferência electrónica a várias distâncias. O mecanismo descrito, sem precedentes em sistemas biológicos, poderá ser vantajoso durante a redução de metais. Finalmente, o citocromo trihémico periplasmático GSU0105 foi caracterizado por espectroscopias de RPE, RMN e UV-visível, tendo estas demonstrado que a proteína contém um grupo hemo que sofre uma conversão de spin-baixo para spin-alto dependente do estado redox. Ademais, o potencial de redução deste hemo é modulado pelo pH da solução, que controla indirectamente a conversão do estado de spin, ao promover diferentes conformações estruturais. Globalmente, estes resultados constituem um contributo importante para o nosso conhecimento actual dos mecanismos de TEE de G. sulfurreducens e para o desenvolvimento de TEM mais eficientes.

Electroactive microorganisms possess the remarkable ability to transfer electrons extracellularly, enabling innovative applications in microbial electrochemical technologies (MET). Despite their widely accepted potential, the application and efficiency of these technologies is scarce, largely due to their low-current production. Subsequently, understanding the fundamental mechanisms that govern extracellular electron transfer (EET) in electroactive microorganisms, from a structural and functional perspective, is a critical step towards the optimization of these processes. Geobacter sulfurreducens is a model electroactive Gram-negative bacterium that is associated with the highest current densities observed in MET. Genetic and proteomic studies have identified some of the main players in this bacterium’s EET pathways, but the precise mechanisms underlying this complex and dynamic process are still under scrutiny. The work developed in this Thesis uses a combination of biophysical techniques and computational methods to provide insights on several players of the EET routes of G. sulfurreducens. AlphaFold 2 model predictions of the porin-cytochrome complexes of this bacterium provided insights on heme axial coordination and spatial disposition, fold arrangement, function and overall assembly of these multiprotein complexes. This information was explored to define new protein production strategies. NMR and SAXS studies showed that the small periplasmic protein ExtJ, part of the ExtHIJKL porin-cytochrome complex, forms homodimers by establishing intramolecular disulfide bridges through a cysteine residue located in its flexible C-terminal domain. The solution structure of this protein is homologous to those of flavin-binding proteins, however, the protein does not bind FMN. AlphaFold-Multimer predictions suggest that ExtJ might interact with the ExtI β-barrel porin. We postulate that the protein homodimerization is controlled by cellular mechanisms of disulfide bridge formation and cleavage, which concomitantly regulate the formation of the transient ExtI-ExtJ complex and the flow of small molecules through this porin. The extracellular cytochrome PgcA possesses a fuzzy structure with three cytochrome domains linked by unstructured stretches. Biophysical studies performed on the individual domains and the full-length cytochrome showed that the protein is able to establish a flexible electron chain, adopting multiple conformations that promote electron transfer at variable distances. This tethered diffusion mechanism, unprecedented in biological systems, might be advantageous during metal reduction. Finally, the periplasmic triheme cytochrome GSU0105 was characterized by EPR, NMR and UV-visible spectroscopies, which showed that the protein contains one heme group that undergoes a redox state dependent low- to high-spin interconversion. Moreover, the reduction potential of this heme is modulated by the solution pH, which indirectly controls the spin state interconversion by promoting different structural conformations. Overall, these results constitute an important contribute to the current understanding of the EET mechanisms of G. sulfurreducens and towards the development of efficient MET.