Understanding a new respiratory route in Geobacter: characterization of the inner membrane associated cytochrome CbcS

Abstract

Geobacter species are recognized for their unique metabolic capabilities, especially their ability to use various extracellular compounds, such as insoluble metals, as electron acceptors in the process of extracellular electron transfer (EET). Among these, Geobacter sulfurreducens has been the most thoroughly investigated. Studies using gene knockout and proteomics have identified essential proteins involved in EET mechanisms. A crucial step in this process involves electron transfer from the menaquinone pool to the quinone-cytochrome c oxidoreductase complexes located in the inner membrane, which then assist the transfer to their redox partners in the periplasm. G. sulfurreducens genome codes for six inner membrane oxidoreductase gene clusters, three of which - CbcL, ImcH and CbcBA – have been already associated to specific metabolic pathways. This thesis focused on cloning, expressing, purifying and biochemical characterizing CbcS, a multiheme cytochrome c from the Cbc4 complex, a recently identified quinone-cytochrome c oxidoreductase complex. The tetraheme periplasmic domain of CbcS was cloned into four different constructs and heterologously expressed in E. coli. The purification of CbcS was optimized and several techniques were used to explore its structural and functional properties. Potentiometric redox titrations were conducted to determine the reduction potential of the protein at pH 7 and pH 8, while Nuclear Magnetic Resonance (NMR) was employed to analyze the spin state of the heme groups and to confirm the hemecore arrangement predicted by AlphaFold. In the context of the EET pathways of G. sulfurreducens, the electron transfer between CbcS and PpcA was monitored by NMR. The results obtained in this thesis offer new insights towards a new respiratory route in Geobacter.

A espécie Geobacter é reconhecida pelas suas capacidades metabólicas únicas, especialmente na capacidade que tem em utilizar diversos compostos presentes no exterior da célula, tais como metais insolúveis, como aceitadores de eletrões no processo de transferência de eletrões extracelular (TEE). Dentro desta espécie, Geobacter sulfurreducens é a que tem sido mais extensivamente estudada. Diversos estudos de deleção de genes e proteómica identificaram as proteínas essenciais que estão envolvidas no processo de TEE. Uma etapa crucial deste processo envolve a transferência de eletrões das menaquinonas para os complexos de oxidorredutases quinona-citocromo c localizados na membrana interna, que depois auxiliam a transferência para os seus parceiros redox no periplasma. O genoma de G. sulfurreducens codifica para seis grupos de genes de oxidorredutases da membrana interna, três dos quais – CbcL, ImcH e CbcBA – foram já associados a vias metabólicas especificas. Esta tese focou-se na clonagem, expressão, purificação e caracterização bioquímica do CbcS, um citocromo c multihémico que pertence ao complexo Cbc4, um complexo de oxidorredutases quinona-citocromo c recentemente identificado. O domínio periplasmático tetrahémico do CbcS foi clonado de quatro formas diferentes e expresso heterologamente em E. coli. As condições de purificação do CbcS foram otimizadas e diversas técnicas foram utilizadas para explorar as suas propriedades estruturais e funcionais. Foram efetuadas titulações potenciométricas para determinar o potencial de redução da proteína a pH 7 e a pH 8. A técnica de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) foi utilizada para analisar o estado de spin dos hemos e para confirmar o arranjo tridimensional previsto pelo modelo AlphaFold. No contexto das vias de TEE em G. sulfurreducens a transferência de eletrões entre CbcS e PpcA foi monitorizada por RMN. Os resultados obtidos nesta tese oferecem novas perspetivas sobre uma nova via respiratória na espécie Geobacter.