Towards phenazine nanoformulations against Staphylococcus aureus infections

Abstract

Prosthetic joint infections (PJI) are a major complication of joint replacement surgeries caused by persistent biofilms and are often associated with multidrug-resistant bacteria. PJI can lead to prosthesis failure, increased healthcare costs, increased risk of chronic and relapsing disease, and increased mortality. The limitations of current treatment options have created an urgent need for effective solutions, such as antimicrobial nanocoatings of the prosthetic material. Microbial phenazines are promising agents against biofilm-forming pathogens, usually with broad-spectrum antimicrobial and antibiofilm activity properties. However, most phenazines lack systematic characterization of their properties. Likewise, silver nanoparticles (AgNP) are candidates for PJI treatment due to their broad-spectrum antimicrobial activity, reported low eukaryotic cytotoxicity and their capability to promote bone regeneration. Star-shaped AgNP (AgNS) have shown enhanced antimicrobial potential within AgNP but have their biomedical application largely unexplored. This master’s thesis was carried out in the scope of the COLOR2COAT project for the development of antimicrobial coating of titanium alloy prosthetic materials using a microbial phenazine (designated as HP) and silver nanoparticles. The work aimed to characterize the antimicrobial and antibiofilm activity of HP and AgNS, against the PJI-relevant pathogen Staphylococcus aureus. The antibacterial activity of both HP and AgNS was determined against planktonic S. aureus ATCC 6538 cells, by estimating the minimum inhibitory concentration (MIC), and, in the case of HP, also through time-kill curves. The inhibition and eradication of biofilms were evaluated by quantifying S. aureus biofilm biomass. By using 250 μM of HP (MICHP), the growth of S. aureus planktonic cells was inhibited by 90% after 90 min of exposure, and completely after 24 h. When 2× MICHP concentration was applied, HP reduced biofilm biomass to around 85% and the average height to approximately 75%, in both biofilm inhibition and eradication assays. In the case of AgNS, S. aureus growth was completely inhibited after 24 h with 7.14 pM of AgNS (MICNS). When using the MICNS concentration to inhibit and eradicate biofilms, AgNS decreased biofilm biomass by 87% and 49% respectively. The mechanisms of action of HP and AgNS antibiofilm activity were characterized by quantifying the levels of reactive oxygen species (ROS) and changes in membrane potential through fluorescence spectroscopy. For HP, confocal scanning light sheet microscopy was also used to determine cell permeability and viability within biofilms, at the cellular level. The MICHP concentration decreased the live/dead cells ratio by 2.6-fold after 90 min, while increasing intracellular ROS levels by 4.0-fold and increased membrane potential by 1.3-fold. Moreover, AgNS caused a hyperpolarisation of the bacterial membrane by 1.7-fold and increased ROS levels by 5.0-fold. Moreover, in the scope of the COLOR2COAT project, initial tests for the biotechnological production of HP were also performed. HP was heterologously produced in Escherichia coli with optimization of the production time and the extraction methodology (e.g., solvent and pH). The work demonstrated the potential of HP and AgNS as novel therapeutics against S. aureus biofilms. The successful production of HP in E. coli may enable a more sustainable production of the phenazine, and thereby, once optimized, of the environmentally friendly development of a phenazine-based coating. Further research is needed to establish and characterize the potential of both HP and AgNS to be used in coatings for the treatment and prevention of PJI.

As infecções de próteses são complicações associadas às artroplastias causadas por biofilmes persistentes e estão frequentemente associadas a bactérias multirresistentes. Estas infeções podem levar à falha da prótese, aumento dos custos de saúde, aumento do risco de doenças crônicas e a um aumento da mortalidade. As opções de tratamento atuais são limitadas e criaram uma necessidade urgente de desenvolvimento de soluções eficazes, como nanorevestimentos antimicrobianos para o material prostético. As fenazinas microbianas são agentes promissores contra microrganismos formadores de biofilme, com atividade antimicrobiana e antibiofilme de amplo espectro. Contudo, a maioria destas fenazinas carece de caracterização sistematizada das suas propriedades. Da mesma forma, as nanopartículas de prata (AgNP) são candidatas ao tratamento de infeções de próteses devido a terem atividade antimicrobiana de largo espectro, baixa citotoxicidade eucariótica e à sua capacidade de promoverem a regeneração óssea. AgNP em forma de estrela (AgNS) mostraram ser AgNP com um maior potencial antimicrobiano, mas ainda têm o seu potencial e aplicação biomédica amplamente inexplorados. Esta dissertação de mestrado foi realizada no âmbito do projeto COLOR2COAT, que tem como objetivo o desenvolvimento de revestimentos antimicrobianos para materiais prostéticos de titânio, através da utilização de uma fenazina microbiana (aqui designada por HP) e nanopartículas de prata. Este trabalho teve como objetivo caracterizar a atividade antimicrobiana e antibiofilme da HP e das AgNS, contra Staphylococcus aureus, um agente patogénico relevante nas infeções de próteses. A atividade antibacteriana da HP e das AgNS foi determinada contra células planctónicas de S. aureus ATCC 6538, através de uma estimativa da concentração inibitória mínima (MIC) e, no caso da HP, também através de cinética de morte ao longo do tempo. A inibição e erradicação de biofilmes foram avaliadas através da quantificação da biomassa do biofilme de S. aureus. Ao utilizar 250 μM de HP (MICHP), o crescimento de células planctónicas de S. aureus foi inibido em 90% após 90 min de exposição e completamente após 24 h. Após adicionar uma concentração de 2× MICHP, a HP reduziu em relação ao biofilme inicial a biomassa em cerca de 85% e a altura média em aproximadamente 75%, tanto nos ensaios de inibição como de erradicação do biofilme. Com as AgNS, o crescimento de S. aureus foi completamente inibido após 24 h após a adição de 7,14 μM de AgNS (MICNS). Ao usar uma concentração de MICNS para inibir e erradicar biofilmes, as AgNS diminuíram a biomassa do biofilme em 87% e 49%, respetivamente. Os mecanismos de ação da atividade antibiofilme da HP e das AgNS foram caracterizados pela quantificação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) e alterações no potencial de membrana, usando espectroscopia de fluorescência. No caso da HP, também foi utilizado microscopia confocal para determinar a permeabilidade e viabilidade celular dos biofilmes. A adição de uma concentração de MICHP causou uma diminuição da proporção de células vivas/mortas 2,6 vezes após 90 min, aumentou os níveis intracelulares de ROS 4,0 vezes e provocou um aumentou do potencial de membrana em 1,3 vezes. As AgNS causaram um aumento da polarização da membrana bacteriana em 1,7 vezes e um aumento dos níveis de ROS em 5 vezes. No âmbito do projeto COLOR2COAT também foram realizados testes iniciais para a produção biotecnológica da HP. A HP foi produzida de forma heteróloga em Escherichia coli, com otimização do tempo de produção e da metodologia de extração (como por exemplo, solvente e pH). Este trabalho demonstrou o potencial da HP e das AgNS como novas terapêuticas contra biofilmes de S. aureus. A produção bem-sucedida da HP em E. coli poderá permitir uma produção mais sustentável desta fenazina e, uma vez otimizada, o desenvolvimento sustentável de nanorevestimentos com a sua incorporação. Mais investigação é necessária para estabelecer a produção, otimizar e caracterizar os potenciais revestimentos de implantes como abordagem terapêutica para infeções de próteses.