Bacteriocins as a tool to prevent pneumococcal colonization

Abstract

As bacteriocinas são péptidos antimicrobianos produzidos por bactérias que frequentemente têm como alvo espécies bacterianas filogeneticamente relacionadas com a estirpe produtora. A utilização de bacteriocinas tem-se tornado cada vez mais relevante, especialmente nos casos em que os agentes patogénicos desenvolveram resistência aos antibióticos.

Streptococcus pneumoniae é um agente patogénico classificado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) na categoria de prioridade média, refletindo a necessidade urgente de gerir e mitigar o seu impacto na saúde pública. A potencial utilização de bacteriocinas contra S. pneumoniae é apelativa, uma vez que, ao contrário dos antibióticos, prevê-se que estas tenham um menor impacto na microbiota humana e uma menor probabilidade de induzir resistência.

Anteriormente, sete estirpes de estreptococos comensais (estirpes A22 a G22) foram identificadas como tendo uma ampla atividade antipneumocócica. A análise in silico dos seus genomas revelou a presença de 24 loci de bacteriocinas. Cada um destes loci codifica vários genes putativos de bacteriocinas (num total de 73 genes). A construção de mutantes de deleção da região que codifica bacteriocinas demonstrou o papel destes loci na atividade inibitória das estirpes.

Neste estudo propusemo-nos a identificar bacteriocinas das estirpes A22 a G22 com potencial para serem utilizadas no controlo da colonização por pneumococos. Para tal, realizámos um rastreio de alto rendimento a 58 bacteriocinas utilizando um kit comercial para fazer a síntese in vitro destas bacteriocinas. Para identificar as que apresentavam atividade antipneumocócica foram realizados ensaios em meio planctónico e sólido. De seguida, uma única bacteriocina (BlpOlike2) com atividade antipneumocócica potente foi escolhida para ser expressa e purificada por expressão heteróloga. Para a purificação, foi adicionada uma His-tag composta por oito histidinas ao N-terminal da bacteriocina. Posteriormente, a sua concentração mínima inibitória foi determinada contra a estirpe de referência S. pneumoniae D39 e 13 outras estirpes com serótipos epidemiologicamente relevantes. A concentração mínima inibitória foi determinada no intervalo de 13,5 a 432 nM. Finalmente, a utilização de microscopia eletrónica de varrimento revelou alterações morfológicas significativas na estirpe S. pneumoniae D39, quando na presença de 8xHis- BlpOlike2.

Em conclusão, identificámos 11 bacteriocinas com potencial para serem utilizadas contra S. pneumoniae. Destas, a BlpOlike2 foi a bacteriocina mais promissora e demonstrou ter atividade antipneumocócica contra todos os serótipos testados com uma concentração mínima inibitória baixa. Além disso, verificou-se que esta bacteriocina tem impacto na estrutura celular de S. pneumoniae.

Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by bacteria usually targeting closely related bacterial species. Recently, their application has become increasingly relevant, particularly in cases where pathogens have developed resistance to antibiotics.

Streptococcus pneumoniae is a pathogen identified by the World Health Organization (WHO) as an emerging global health crisis. The potential use of bacteriocins against S. pneumoniae is appealing due to their targeted mode of action. In contrast to antibiotics, bacteriocins are predicted to have less impact on the human microbiota and to have reduced likelihood of widespread resistance.

Previously, seven strains of commensal streptococci (strains A22 to G22) were identified due to their broad anti-pneumococcal activity. In silico analysis of their genomes revealed the presence of 24 bacteriocin loci comprising an arsenal of 73 putative bacteriocin genes. Although construction of deletion mutants for the bacteriocin loci revealed its role for the anti-pneumococcal phenotype of the strains, it remained unclear which bacteriocins were responsible for the inhibitory activity. Here, we proposed to identify bacteriocins from strains A22 to G22 with the potential to be used to control pneumococcal colonization. For that, we started by performing a high throughput screening using cell-free protein synthesis to identify bacteriocins with anti-pneumococcal activity. After, a single bacteriocin (BlpOlike2) with potent anti-pneumococcal activity was chosen to be expressed and purified by heterologous expression. For the purification, a His-tag composed of eight histidine was added to the N-terminal of the bacteriocin. Then, its minimum inhibitory concentration (MIC) was determined against D39 and 13 other epidemiologically relevant serotypes. The MIC was determined within the range of 13.5 to 432 nM. Finally, scanning electron microscopy revealed that S. pneumoniae D39, when in the presence of 8xHis-BlpOlike2, suffers severe conformational changes.

In conclusion, we identified 11 bacteriocins with the potential to be used against S. pneumoniae. Of these, BlpOlike2 was the most promising bacteriocin and displayed anti- pneumococcal against all tested serotypes with low MIC. Furthermore, this bacteriocin was found to impact the cellular structure of S. pneumoniae.