Otimização e aplicação de um teste de imunofluorescência indireta para o diagnóstico de leptospirose em laboratórios convencionais

Abstract

RESUMO A leptospirose é uma zoonose re-emergente com distribuição mundial, com mais de 1.000.000 de casos graves notificados anualmente na população humana. É causada por espiroquetas patogénicas do género Leptospira. O diagnóstico definitivo da leptospirose, juntamente com achados clínicos e epidemiológicos compatíveis, baseia-se no Teste de Aglutinação Microscópica (TAM), um teste sorológico de referência recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) o qual, no entanto, está apenas disponível nos laboratórios de referência em alguns países nos diversos continentes, com base em cerca de três dezenas de serovares de Leptospira interrogans sensu lato. (s.l.). Assim, este estudo visa otimizar um teste de imunofluorescência indireta (Lept-IFA) alternativo à TAM que possa ser útil para o diagnóstico da referida doença, utilizando apenas três sorovares patogénicos, reconhecidos em Portugal, pela alta e ubíqua prevalência. Utilizaram-se os serovares: Copenhageni, Arborea e Pomona representativos de L interrogans s.l. e o serovar Patoc de L. biflexa s.l. (espécie saprófita) os quais foram mantidos em meio de cultura Ellinghaussen, McCullough, Jonhson e Harris (EMJH), até à sua utilização. A fim de preservar as proteínas leptospíricas de superfície da membrana externa as espiroquetas foram centrifugadas a baixa velocidade e o lisado obtido colocado nos diversos poços da lâmina do teste IFA, previamente revestida com lisina e depois fixada com formalina. Foi testado por Lept-IFA um total (N=50) de amostras de soro humano, selecionadas do laboratório de leptospirose/BioBanco do IHMT NOVA, com indicação clínica de possível leptospirose e previamente analisadas por TAM, utilizaramse também como controlo negativo, soros representativos de população saudável e soros testados para dois outros espiroquetas (Borrelia burgdorferi s.l. e Treponema sp), agentes etiológicos da borreliose de Lyme e sífilis, respetivamente. O teste Lept-IFA confirmou todas as amostras positivas testadas por TAM (19+; 38%), (6; 12%) das amostras mostraram resultado não conclusivo (NC), tendo o resultado sido negativo nas restantes amostras (25; 50%). No grupo de soros com resultado não conclusivo, os soros (controlo) de borreliose de Lyme verificou-se uma reação cruzada com o serovar Patoc. Este estudo mostrou que o Lept-IFA pode ser uma ferramenta útil como teste de triagem de primeira linha para o diagnóstico sorológico da leptospirose em regiões/países cujos laboratórios não dispõem do teste de referência recomendado pela OMS. No entanto, o teste Lept-IFA carece de padronização confiável e depende muito da qualificação do observador.

Leptospirosis is a reemerging zoonosis with worldwide distribution, with more than 1,000,000 severe cases notified annually in the human population. It is caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. The definitive diagnosis of leptospirosis, together with compatible clinical and epidemiological findings, is based on the Microscopic Agglutination Test (MAT), a reference serological test recommended by the World Health Organization (WHO), that is based on about three dozen serovars of Leptospira interrogans sensu lato.(s.1.), however this test is only available in the reference laboratories in some countries on different continents. This study aims to optimize an indirect immunofluorescence test (Lept-IFA) alternative to TAM that may be useful for the diagnosis of leptospirosis, using only three pathogenic serovars, recognized in Portugal for their high and ubiquitous prevalence. The serovars Copenhageni, Arborea and Pomona, representative of L interrogans s.l.. and the serovar Patoc, from L. biflexa s.l. (saprophytic species), were maintained in Ellinghaussen, McCullough, Johnson and Harris (EMJH) culture medium until use. In order to preserve the leptospiral proteins on the surface of the outer membrane, the spirochetes were centrifuged at low speed and the pellet obtained was resuspended in buffer and placed in each well of the IFA slide, previously coated with lysine, and then fixed with formalin. Fifty human serum samples (N=50), selected from the leptospirosis laboratory/BioBank of IHMT NOVA, with clinical indication for leptospirosis and previously analyzed by TAM, were tested by Lept-IFA. A representative serum from a healthy population and sera tested for two other spirochetes (Borrelia burgdorferi s.l. and Treponema sp), etiological agents of Lyme borreliosis and syphilis, respectively, were used as negative controls. The Lept-IFA confirmed all positive samples tested by TAM (19+; 38%), 12% (n=6) of the samples showed inconclusive results (NC), and the remaining 50% were negative (n=25). In the inconclusive sera group, both Lyme borreliosis sera (controls) crossreacted with Patoc serovar. This study has shown that Lept-IFA can be a useful tool as a first-line screening test for the serological diagnosis of leptospirosis in regions/countries whose laboratories do not have the reference test recommended by the WHO. However, the Lept-IFA test lacks reliable standardization and depends heavily on the qualifications of the observer.