Cryobiophysics: Structure-Function-Property-Design Interplay of Polysaccharides in Crystal Binding

Abstract

A criopreservação de matéria biológica tem despertado grande interesse na ciência médica pelo seu potencial em prolongar o tempo de preservação de órgãos, alimentos e alongar a esperança média de vida. Esta dissertação explora profundamente as relações estrutura-função de polissacáridos biocompatíveis em crioproteção, revelando novos mecanismos e desafiando pressupostos científicos em criobiologia. Polissacáridos crioprotetores provenientes de microorganismos aclimatizados ao frio apresentam um maior peso molecular, conteúdo em ácidos urónicos electronegativos e uma incidência para possuir fucose na cadeia polimérica, corroborado experimentalmente pelo perfil composicional de crioprotetores eficientes na criopreservação de células Vero. O papel-chave da fucose parece estar conectado, ao contrário dos ácidos urónicos, a um mecanismo independente de carga formal que regula a estabilização da membrana celular, contrapondo-se às flutuações volumétricas citosólicas durante o congelamento. Os polissacáridos crioprotetores também possuem uma conformação estrutural mais ordenada em vez de disposições “random coil”, permitindo que passem por uma transição sol-gel a temperaturas hipotérmicas. A anticipação do ponto de solidificação da água leva a cristais de gelo menores e advém de uma forte influência na nucleação de gelo, perturbando a organização difusiva de moléculas de água em núcleos de gelo estáveis. O FucoPol em particular demonstrou um carácter mais determinístico na distribuição de temperaturas de nucleação, associado a uma redução na estocasticidade da nucleação, levando a um maior controlo experimental e sendo benéfico no “design” de protocolos de biopreservação. Por fim, o efeito dualista anti-nucleação e pró-nucleação do FucoPol foi racionalizado através dos formalismos da Teoria Clássica da Nucleação. A hipótese assente é que o desempenho crioprotetor do FucoPol surge de uma inibição cinética, mediada pela viscosidade, da dinâmica de difusão molecular, um efeito modulatório Gibbs-Thomson da cristalização similar a proteínas anticongelamento, e a formação de um gel que exerce influência em ambas as interfaces polisacárido-célula e polisacárido-gelo, respetivamente ao minimizar o dano mecânico na membrana celular durante a congelação e confinando volumetricamente moléculas de água em poros de tamanho definido, aumentado a tensão interfacial, promovendo a nucleação em dimensões uniformes e impedindo a formação de núcleos maiores, assim explicando o viés assimétrico de sobrevivência de núcleos pequenos.

Cryopreservation of biological matter has accumulated apex interest in medical science for its potential in elongating organ shelf-life, food storage and human life expectancy. Here, hidden structure-function relationships of biocompatible polysaccharides in successful cryoprotection were deeply explored, to unveil novel mechanistic rationales and challenge pre-established assumptions in cryobiology. Cryoprotective polysaccharides from cold-adapted microorganisms show an increased molecular weight, prominent negatively charged uronic acids and a particular incidence towards fucose in the polymer chain, which correlates experimentally with the compositional profile of the high-tier cryoprotectants in Vero cell cryopreservation. The key role of fucose appears connected, unlike uronic acids, to a charge-independent mechanism regulating cell membrane stabilization counteracting cytosolic volumetric fluctuations during freezing. Cryoprotective polysaccharides also possess an ordered structural conformation rather than random coil dispositions, allowing them to undergo a sol-gel transition at hypothermic temperatures. The freezing point supercooling attenuation as an anticipation of crystal growth leads to smaller ice crystals and arises from a strong influence in ice nucleation, disrupting diffusive assembly of water molecules into stable ice nuclei. FucoPol in particular demonstrated an increased determinism in nucleation temperature distribution, associated to a reduction in nucleation stochasticity, enhanced experimental control, thus beneficial to biopreservation protocol design. Lastly, the anti-nucleation and pro-nucleation effect duality of FucoPol was rationalized using Classical Nucleation Theory formalisms. The withstanding hypothesis is that polysaccharide cryoprotective performance arises from a combination of a kinetic viscosity-mediated impairment of diffusive dynamics, a Gibbs-Thomson ice modulatory effect similar to antifreeze proteins, and the formation of a gel-like matrix which exerts influence both in polysaccharide-cell and polysaccharide-ice interfaces, respectively by minimizing cell membrane mechanical strain during freezing and volumetrically confining water molecules in defined pores, which increases interfacial tension, promotes nucleation and size uniformity, and quenches larger nuclei from forming, thus explaining the asymmetric small nuclei survivorship bias.