Avaliação da citotoxicidade e atividade de inibição de efluxo de fenotiazinas e do verapamil em Neisseria gonorrhoeae

Abstract

Neisseria gonorrhoeae é o agente etiológico da gonorreia, uma infeção sexualmente transmissível. Em 2020, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou aproximadamente 82,4 milhões de novos casos de infeções por N. gonorrhoeae, constituindo um grave problema de saúde pública. A emergência de estirpes resistentes aos antimicrobianos atualmente disponíveis para o tratamento destas infeções, levou a OMS a classificar N. gonorrhoeae resistente às cefalosporinas e fluoroquinolonas como um microrganismo prioritário para o desenvolvimento de novos fármacos. O reposicionamento de fármacos consiste em procurar novas aplicações terapêuticas para fármacos já existentes, utilizados no tratamento de outras doenças, permitindo acelerar o processo de desenvolvimento de novos compostos e reduzir custos. As bombas de efluxo desempenham um papel relevante no desenvolvimento de resistência aos antimicrobianos em N. gonorrhoeae, constituindo um alvo atrativo para o desenvolvimento de novos fármacos, em particular inibidores de efluxo. Os fármacos antipsicóticos do grupo das fenotiazinas e o composto antiarrítmico verapamil (Vp) foram descritos como inibidores de efluxo em diversas bactérias, promovendo a atividade de antibióticos em estirpes resistentes. A atividade destes fármacos contra N. gonorrhoeae ainda se encontra pouco explorada. Nesta Dissertação, avaliou-se a atividade in vitro e potencial efeito inibitório de efluxo das fenotiazinas clorpromazina (Cpz) e tioridazina (Tz) e do Vp em N. gonorrhoeae, e a sua citotoxicidade em linhas celulares de mamífero. Determinou-se a Concentração Mínima Inibitória (CMI) de cada fármaco contra a estirpe de referência N. gonorrhoeae ATCC 49226, pelo método de microdiluição. De seguida, avaliou-se o potencial efeito adjuvante dos fármacos candidatos na atividade de antibióticos e do brometo de etídio (EtBr), um substrato comum de bombas de efluxo. Para avaliar a potencial atividade inibitória de efluxo dos fármacos estudados e o seu efeito no potencial de membrana de N. gonorrhoeae, efetuaram-se ensaios de acumulação de EtBr e do corante iodeto de 3,3′-dietiloxacarbocianina [DiOC2(3)], por fluorometria em tempo real. Finalmente, avaliou-se a citotoxicidade dos fármacos em duas linhas celulares de mamífero, HepG2 e Vero. Verificou-se que a Tz apresentou o valor de CMI mais baixo dos três fármacos estudados contra N. gonorrhoeae ATCC 49226. Apesar de não se verificar efeito adjuvante na atividade de antibióticos, o Vp reduziu significativamente a CMI do EtBr na estirpe estudada. Este fármaco também demonstrou atividade inibitória de efluxo nos ensaios de acumulação de EtBr. Todos os fármacos demonstraram efeito sobre o potencial de membrana de N. gonorrhoeae. Por fim, observou-se viabilidade celular ≥90% na presença da maioria dos fármacos a 0,1× CMI, em ambas as linhas celulares. Em particular, o Vp não mostrou citotoxicidade na concentração correspondente à sua CMI na linha celular Vero. Concluindo, os fármacos estudados, em particular o Vp, revelaram ser promissores para o futuro desenvolvimento de inibidores de efluxo que possam ser utilizados no combate à resistência aos antimicrobianos em N. gonorrhoeae.

Neisseria gonorrhoeae is the etiological agent of gonorrhea, a sexually transmitted infection. In 2020, the World Health Organization (WHO) estimated approximately 82.4 million new cases of infections by N. gonorrhoeae, constituting a serious public health problem. The emergence of strains resistant to antimicrobials currently available for the treatment of these infections, led the WHO to classify N. gonorrhoeae resistant to cephalosporins and fluoroquinolones as a priority microorganism for new drug development. Drug repositioning consists in searching for new therapeutic applications for already existing drugs, used in the treatment of other diseases, allowing the acceleration of the development process of new compounds and cost reduction. Efflux pumps play an important role in the development of antimicrobial resistance in N. gonorrhoeae, becoming an attractive target for new drug development, in particular efflux inhibitors. Antipsychotic drugs from the phenothiazine group and the antiarrhythmic compound verapamil (Vp) have been described as inhibitors of efflux activity in several bacteria, promoting the activity of antibiotics in resistant strains. The activity of these drugs against N. gonorrhoeae is still largely unexplored. In this Dissertation, we evaluated the in vitro activity and potential efflux inhibitory effect of the phenothiazines chlorpromazine (Cpz) and thioridazine (Tz) and Vp on N. gonorrhoeae, and their cytotoxicity on mammalian cell lines. We determined the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of each drug against the reference strain N. gonorrhoeae ATCC 49226, by the microdilution method. Next, we evaluated the potential adjuvant effect of the candidate drugs on the activity of antibiotics and ethidium bromide (EtBr), a common efflux pump substrate. To assess the potential efflux inhibitory activity of the studied drugs and their effect on the membrane potential of N. gonorrhoeae, we performed accumulation assays using real-time fluorometry with EtBr and 3,3´-diethyloxacarbocyanine iodide [DiOC2(3)]. Finally, we evaluated drug cytotoxicity in two mammalian cell lines, HepG2 and Vero. We found that Tz showed the lowest MIC value of the three drugs studied against N. gonorrhoeae ATCC 49226. Although there was no adjuvant effect of antibiotic activity, Vp significantly reduced the MIC of EtBr in the studied strain. This drug also demonstrated efflux inhibitory activity in EtBr accumulation assays. All drugs demonstrated an effect on the membrane potential of N. gonorrhoeae. Finally, we observed cell viability ≥90% in the presence of most drugs at 0,1× MIC, in both cell lines. In particular, Vp did not show cytotoxicity at the concentration corresponding to its MIC in the Vero cell line. In conclusion, the studied drugs, in particular Vp, revealed to be promising for the future development of efflux inhibitors that may be used to combat antimicrobial resistance in N. gonorrhoeae.