Enhanced polyhydroxyalkanoates productivity from ethanol-rich feedstocks: knowledge-based process design and online monitoring

Abstract

Os polihidroxialcanoatos (PHAs) são poliésteres considerados como uma possível alternativa para substituir os plásticos sintéticos. Os PHAs apresentam propriedades de termoplásticos semelhantes às dos plásticos convencionais, com a vantagem de serem biodegradáveis, biocompatíveis e de serem produzidos a partir de recursos renováveis. No entanto, os PHAs são atualmente produzidos por culturas puras e os seus elevados custos de produção constituem um obstáculo à sua disseminação em larga escala como plásticos de comodidade. Nas últimas décadas, a investigação tem-se focado no desenvolvimento de processos de produção alternativos que possam reduzir substancialmente os custos de produção do PHA. As culturas microbianas mistas (MMC) têm sido cada vez mais investigadas como uma forma de reduzir os custos de produção dos PHAs através do uso combinado de sistemas abertos e de substratos baseados em resíduos de baixo custo. A produção de PHA por MMCs é normalmente efetuada num processo com três fases: a fermentação acidogénica onde os resíduos/subprodutos agroindustriais são convertidos numa mistura de ácidos orgânicos voláteis (VFAs), os precursores mais comuns de PHAs; a seleção da cultura para obter um enriquecimento microbiano com elevada capacidade de produção de PHA; e a acumulação de PHA onde o conteúdo de PHA da cultura selecionada é maximizado. A produção de PHA por MMCs normalmente está dependente do fornecimento de uma corrente rica em VFAs, apesar de por vezes, devido a flutuações na fase de acidogénese, correntes maioritariamente constituídas por VFAs poderem ser difíceis de obter. Apesar de comuns, composições de substratos diferentes das típicas correntes enriquecidas em VFAs são raramente exploradas. Este conhecimento poderá ser valioso na medida que contribuirá para a simplificação do processo de produção de PHA por MMCs e levará à subsequente diminuição dos custos de produção. Este projeto de doutoramento focou-se no estudo do impacto da composição de substratos fermentados em termos de fontes de carbono como o etanol e o lactato, no processo de produção de PHA por MMC, tanto na fase de seleção da cultura como na fase de produção de PHA. No primeiro estudo deste projeto de doutoramento, a seleção da cultura foi efetuada num reator descontínuo sequencial (SBR) operado a uma carga orgânica (OLR) de 100 Cmmol.L-1.d-1. O reator foi alimentado com um efluente fermentado de uma indústria produtora de guloseimas, que era maioritariamente constituído por lactato e etanol (60-90% do total de produtos de fermentação solúveis (SFPs)), tendo-se alcançado um robusto enriquecimento em microrganismos produtores de PHA , tendo sido atingindo um conteúdo em PHA de 52.6 ± 0.4 wt.% nos testes de acumulação. Um aumento da carga orgânica na fase de seleção da cultura de 100 para 150 Cmmol.L-1.d-1 levou a um conteúdo de PHA de 59.1 ± 0.6 wt.%, um rendimento de 0.93 ± 0.01 Cmol-PHA.Cmol-S-1 e uma produtividade de 0.93 ± 0.01 g-PHA L-1.h-1. A produção de SFPs que não são VFAs durante a fase de fermentação acidogénica é bastante comum, e os resultados obtidos neste trabalho realçam que a produção de uma composto inibitório (etanol) não tem de comprometer o alcance de rendimentos e produtividades de produção de PHA competitivas. No segundo estudo deste projeto de doutoramento, foi investigado o impacto do teor em etanol na acumulação de PHA e no fluxo de carbono do processo. Neste estudo, a seleção de um enriquecimento bacteriano com capacidade de acumular PHA foi efetuado num SBR operado a uma carga orgânica de 100 Cmmol.L-1.d-1 e alimentado com um substrato sintético constituído por etanol e ácidos láctido, acético e butírico. No decorrer dos ensaios observou-se a produção simultânea de PHA e de substâncias poliméricas extracelulares (EPS). Potencialmente a matriz de EPS foi produzida como estratégia de proteção, permitindo à biomassa ultrapassar o impacto dos conteúdos crescentes de etanol e mesmo assim continuar a produzir PHA. Com o aumento do conteúdo de etanol de 5 to 20 Cmmol.L-1 o rendimento de produção de PHA diminuiu de 0.92 ± 0.004 para 0.63 ± 0.002 Cmol-PHA.Cmol-S-1. A produção de EPS foi diretamente proporcional ao conteúdo de etanol alimentado, alcançando um conteúdo total máximo de EPS de 6.70 Cmmol para o máximo de etanol fornecido. Este estudo confirmou que o EPS atuou como uma estratégia de proteção da biomassa, o que beneficiou a taxa específica de produção de PHA para o conteúdo máximo de etanol testado. Para além disso, a produção simultânea de dois biopolímeros de valor acrescentado pode funcionar como uma estratégia de valorizar ainda mais resíduos ricos em etanol. Por último, a possibilidade de usar as técnicas espectroscópicas de Raman e de Infravermelho Próximo (NIR) como ferramentas de monitorização online da fase de acumulação da produção de PHA por MMC foi investigada. Neste estudo, espectros de NIR e de Raman foram adquiridos at line a partir de amostras do reator de acumulação de PHA de forma a desenvolver modelos de calibração de regressão de mínimos quadrados parciais (PLS) para previsão do conteúdo intracelular de PHA e da concentração de etanol. Contudo, devido à interferência de fluorescência nos espectros de Raman, estes não foram usados no desenvolvimento de modelos de calibração. Os espectros de NIR foram usados para o desenvolvimento de modelos de calibração quantitativos obtidos através de regressão PLS. Os modelos desenvolvidos foram sujeitos a validação interna cruzada e a validação externa e mostraram-se adequados para prever os parâmetros em estudo. Para o conteúdo intracelular de PHA na gama de 12.0 – 48.0%, um R2 de validação cruzada de 0.949 e uma raiz quadrada do erro quadrático médio de validação cruzada (RMSECV) de 2.15% foram obtidos, e a validação externa apresentou uma raiz quadrada do erro quadrático médio de previsão (RMSEP) de 2.07%. Para a concentração de etanol na gama de 1.33 – 20.4 Cmmol.L-1, um R2 de validação cruzada de 0.858 e um RMSECV de 1.82 Cmmol.L-1 foram obtidos, e a validação externa apresentou um RMSEP de 1.46 Cmmol.L-1. Estes resultados realçam o potencial da espectroscopia de NIR para a monitorização online da fase de acumulação do processo de produção de PHA usando MMCs e substratos reais/complexos.

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) are bio-based polyesters considered as a possible alternative to replace synthetic plastics. PHAs present thermoplastic properties similar to those of conventional plastics, with the advantage of being biodegradable, biocompatible and produced from renewable sources. However, PHAs are currently synthetized by pure cultures and their high production costs remain as an obstacle to the widespread dissemination of PHAs as commodity plastics. In the last decades, research has focused on the development of substitute production processes that can substantially decrease PHA production costs. Mixed microbial cultures (MMC) have been increasingly investigated as a way of reducing PHA production costs through the combined use of open systems with surplus-based low-cost feedstocks. MMC PHA production is usually performed in a three-stage process comprising: acidogenic fermentation where the agro-industrial wastes/by-products are converted to a fermented stream containing a mixture of volatile fatty acids (VFAs), the standard PHA precursors; culture selection to obtain a PHA-storing microbial enrichment with high PHA production capacity; and PHA accumulation where the PHA content of the selected culture is maximized. PHA MMC production typically relies on a supply of VFA-rich streams, though sometimes, due to fluctuations in the acidogenesis step, VFA-dominant streams can be difficult to attain. Despite being common, feedstock compositions different than the usual VFA-rich streams are rarely explored. This knowledge could be valuable towards the simplification of the MMC PHA production process and lead to subsequent decreases in production costs. This PhD project focused on the study of the impact of fermented feedstock carbon composition, namely ethanol and lactate, on a MMC PHA production process, both in culture selection and PHA accumulation stages. In the first study of this PhD project, culture selection was performed in a sequencing batch reactor (SBR) operated at an organic loading rate (OLR) of 100 Cmmol.L-1.d-1. The reactor was fed with a fermented wastewater from a confectionary industry, which was mostly composed by lactate and ethanol (60-90% of all soluble fermentation products (SFPs)), and a robust PHA-accumulating enrichment was obtained, which produced up to a PHA content of 52.6 ± 0.4 wt.% in accumulation assays. An OLR increase in the culture selection stage to 150 Cmmol.L-1.d-1 led to a PHA content of 59.1 ± 0.6 wt.%, a yield of 0.93 ± 0.01 Cmol-PHA.Cmol-S-1 and a productivity of 0.93 ± 0.01 g-PHA L-1.h-1. The production of non-VFA SFPs during the acidogenic fermentation step was found to be quite common, and the results obtained in this work highlight that the production of an inhibitory substrate (ethanol) does not hinder competitive PHA yields and productivities. In the second study of this PhD project, the impact of ethanol on PHA storage and on the carbon flux of the process were investigated. In this study, the selection of a PHA-accumulating bacterial enrichment was performed in a SBR operated at an OLR of 100 Cmmol.L-1.d-1 and fed with a synthetic feed composed by ethanol, lactic, acetic and butyric acids. Simultaneous production of PHA and extracellular polymeric substances (EPS) was observed, and an EPS matrix was produced as a protection strategy, allowing the biomass to deal with the impact of increasing contents of ethanol and still produce PHA. PHA production yield showed a decrease from 0.92 ± 0.004 to 0.63 ± 0.002 Cmol-PHA.Cmol-S-1 with the increase of ethanol content from 5 to 20 Cmmol.L-1. EPS production was directly proportional to the ethanol fed, reaching a maximum total EPS content of 6.70 Cmmol for the maximum ethanol supplied. This study underlined that EPS acted as a protection strategy for the biomass, which benefited PHA specific storage rate for the highest ethanol content tested. Moreover, the simultaneous production of two value-added biopolymers can act as strategy to further valorise ethanol-rich feedstocks. The possibility of using Raman and Near-infrared (NIR) spectroscopy as online monitoring tools for the PHA accumulation stage of MMC PHA production was further investigated. In this study, NIR and Raman spectra of samples from the PHA accumulation reactor were acquired at line in order to develop partial least squares (PLS) calibration models for predicting intracellular PHA content and ethanol concentrations. Unfortunately, the development of calibration models using Raman spectra was not possible due to the presence of fluorescence interference in the spectra. NIR spectra were used for the development of quantitative calibration models through PLS regression. The developed models were subjected to internal cross-validation and external test set validation and were proved to be suitable for predicting the parameters under study. For intracellular PHA content in the range of 12.0 – 48.0 wt.%, a coefficient of determination of cross-validation (R2CV) of 0.949 and a root mean squared error of cross-validation (RMSECV) of 2.15 wt.% were obtained, and the external validation presented a root mean squared error of prediction (RMSEP) of 2.07 wt.%. For ethanol concentration in the range of 1.33 – 20.4 Cmmol.L-1, a R2CV of 0.858 and a RMSECV of 1.82 Cmmol.L-1 were obtained, and the external validation presented a RMSEP of 1.46 Cmmol.L-1. These results highlight the potential of NIR spectroscopy for online monitoring of the PHA accumulation stage of PHA production process using MMCs and real/complex feedstocks.