Valorisation of brewer’s spent grain through polyhydroxyalkanoates production supported by two-dimensional fluorescence spectroscopy

Abstract

Nos últimos anos, a produção de plásticos em larga-escala tem sido alvo de grandes preocupações devido ao seu impacto no ambiente e na saúde. Os plásticos de origem biológica e biodegradáveis surgiram como uma alternativa ecológica e sustentável aos plásticos convencionais. Os polihidroxialcanoatos (PHA) apresentam-se como uma das alternativas mais adequadas e promissoras dentro do grupo dos bioplásticos, por terem propriedades termoplásticas e por serem polímeros de origem biológica, biodegradáveis e biocompatíveis. A produção de PHA através de culturas microbianas mistas (MMCs) tem-se demonstrado vantajosa em comparação às culturas puras devido ao uso de condições não-assépticas, o que reduz significativamente os custos de operação do processo. O processo de produção de PHA realizado por MMCs engloba três estágios: (1) a fermentação acidogénica, (2) a seleção e enriquecimento de uma cultura em organismos acumuladores de PHA e, finalmente, (3) a acumulação de PHA. Atualmente, estes sistemas biológicos são maioritariamente monitorizados e controlados através de ferramentas offline e lentas, que resultam em respostas tardias e, portanto, numa perda de produtividade do processo. Neste contexto, a espectroscopia de fluorescência bidimensional (2D) tem um enorme potencial para ser utilizada como uma ferramenta de monitorização e controlo dos bioprocessos em tempo real. Por ser uma técnica seletiva, sensível, não invasiva e não destrutiva, esta ferramenta é capaz de adquirir a informação do meio de cultura, online, através de sensores óticos, o que permite identificar precocemente perturbações do processo, mas também o ponto ótimo de cada uma das fases (no caso da produção de PHA pelas MMCs), rumo à maior produtividade do processo. Desta forma, esta tese focou-se na valorização de um subproduto da indústria cervejeira (dreche) para a produção de PHA, usando a espectroscopia de fluorescência 2D como suporte para a monitorização em tempo-real dos sistemas biológicos usados. Foi implementado um processo de 3 estágios para produção de PHA através de MMCs, à escala laboratorial, usando a dreche como matéria-prima, uma vez que é um resíduo rico em carbono, produzido em grandes quantidades em todo o Mundo. A dreche é um material lenhocelulósico com uma estrutura complexa e recalcitrante, o que torna essencial a aplicação de um pré-tratamento antes da sua utilização para processos de fermentação futuros. Assim sendo, o primeiro estudo desta tese de PhD avaliou o impacto de diferentes concentrações de ácido sulfúrico (1 a 5% (w/w)) e rácios de líquido-sólido (6, 8, 10 e 12 g/g) na hidrólise ácida da dreche, com o objetivo de se obterem açúcares fermentáveis. A maior eficiência da hidrólise de 65% foi obtida para a hidrólise realizada a 3% (w/w) de concentração de ácido e com um rácio de liquido-sólido de 10 g/g. O hidrolisado da dreche obtido era, não só, rico em açúcares como também em proteínas e azoto, o que é benéfico quando considerada a sua utilização futura em processos de fermentação. O processo de produção de PHA através das MMCs foi, em primeiro lugar, avaliado no que diz respeito à fermentação acidogénica (estágio 1), usando grânulos anaeróbios, onde se estudou o efeito das flutuações de pH no perfil dos produtos de fermentação (FP) e na composição do microbioma. Além disso, a espectroscopia de fluorescência 2D acoplada a ferramentas quimiométricas foi, pela primeira vez, estudada para a monitorização da fermentação acidogénica. Foram desenvolvidos modelos para prever as concentrações dos FP e da proteína solúvel (SProt) no efluente. Os resultados demonstraram que as flutuações de pH ao longo da operação do reator em contínuo alteraram a composição do microbioma dos grânulos, levando a diferentes perfis dos FP nos efluentes. A espectroscopia de fluorescência 2D foi capaz de captar a tendência dos dados, permitindo prever as concentrações dos FP e da SProt no efluente, com erros médios inferiores a 0.75 e 0.43 g/L, respetivamente, dentro da gama de dados experimentais estudada (0-6.4 e 1.4-6.2 g/L para as concentrações de FP e SProt, respetivamente). De seguida, foi avaliado o impacto de diferentes condições operacionais, nomeadamente da carga orgânica (OLR) (45 and 60 CmmolFP/(L.d) e do tempo de retenção das lamas (SRT) (4 e 2 dias), no desempenho da MMCs durante a seleção da cultura (estágio 2), usando o fermentado da dreche (fBSG) como matéria-prima. Além disso, avaliou-se também o efeito de um período de hibernação no desempenho da cultura, com o objetivo de mimetizar o cenário real de paragem numa indústria. Estudou-se a dinâmica do sistema em relação à produtividade do processo, assim como à composição do microbioma. Os resultados mostraram que a operação do reator a valores superiores de OLR e SRT resultaram na maior produtividade global de PHA de 3.55 ± 0.8 gPHA/(L.d). O período de hibernação, durante o qual o reator foi parado e a biomassa guardada a 4 °C durante 3 meses, não afetou a biomassa uma vez que a sua atividade para a síntese de PHA foi restaurada após algumas semanas. Foi alcançada uma produtividade global de PHA idêntica à obtida anteriormente usando as mesmas condições operacionais, demonstrando a robustez da cultura e do processo. A dinâmica do microbioma ao longo da seleção da cultura revelou que as mudanças nas condições de operação do processo foram acompanhadas de perto por mudanças na estrutura e composição da comunidade microbiana. Apesar disso, o microbioma da biomassa era composto por vários microrganismos produtores de PHA bem conhecidos, que persistiram no microbioma, embora com diferentes abundâncias relativas. A espectroscopia de fluorescência 2D foi posteriormente estudada tendo em vista a monitorização em tempo real do conteúdo intracelular de PHA no reactor de seleção (estágio 2), operado com diferentes condições e usando o fermentado da dreche (fBSG) como matéria-prima. Os primeiros modelos foram desenvolvidos para prever o conteúdo em PHA durante a fase I (OLR de 45 CmmolFP/(L.d) e SRT de 4 dias). Este trabalho apresentou, pela primeira vez, uma boa correlação para a previsão de PHA baseada em medidas de espectroscopia de fluorescência 2D, com um erro médio de cerca de 4.0% gPHA/gTS para novas previsões, destacando-se assim o potencial desta ferramenta de monitorização para avaliar quantitativamente o conteúdo intracelular de PHA sem a necessidade de agentes de coloração. Para além disso, abriu também a possibilidade de uma monitorização online e em tempo real do processo de produção do biopolímero. Posteriormente, foram também desenvolvidos modelos com base na espectroscopia de fluorescência 2D para a previsão do conteúdo de PHA durante o estágio de seleção da cultura (estágio 2), onde as condições operacionais foram alteradas, mas também no estágio de acumulação de PHA (estágio 3), realizado num reator diferente. Boas correlações para a previsão do conteúdo de PHA foram também obtidas ao longo dos estágios de seleção da cultura e de acumulação de PHA, independentemente das diferentes condições de operação. As capacidades de previsão do conteúdo de PHA obtidas pelos modelos desenvolvidos para cada condição de operação específica em comparação com o modelo geral foram idênticas (erros médios de cerca de 4 e 5% gPHA/gTS, respetivamente). Por último, estudou-se ainda a capacidade da espectroscopia de fluorescência 2D para monitorizar o conteúdo de PHA e o peso seco celular (CDW) ao longo de um ensaio de cultivo de uma cultura pura, por forma a investigar a possibilidade de estender esta técnica a processos de produção de PHA atualmente implementados à escala industrial. Ambos os modelos apresentaram bons resultados, com erros médios para novas previsões de 2.8% gPHA/gCDW e 0.8 g/L para o conteúdo de PHA e concentração de CDW, respetivamente, demonstrando que a espectroscopia de fluorescência 2D foi capaz de capturar a informação sobre o meio biológico dos ensaios realizados usando uma cultura pura. Esta tese de doutoramento destaca o elevado potencial da espectroscopia de fluorescência 2D para a monitorização em tempo real dos processos biológicos usados na produção de PHA. Simultaneamente, esta tese permitiu também avaliar o impacto das condições operacionais no processo de produção de PHA através de MMCs e usando o hidrolisado da dreche como matéria-prima.

In the last years, the production of plastics at large-scale has been a subject of great concerns due to their environmental and health impacts. Biobased and biodegradable plastics emerged as an ecological and sustainable alternative to those conventional plastics. Polyhydroxyalkanoates (PHA) presents as one of the most suitable and promising substitutes within the bioplastic group, by having thermoplastic properties and by being biobased, biodegradable and biocompatible polymers. PHA production using mixed microbial cultures (MMCs) have proven advantageous over pure cultures due to the use of non-aseptic conditions, which significantly reduces the process operational costs. The PHA production process using MMCs comprises three stages: (1) acidogenic fermentation, (2) selection and enrichment of a culture in PHA-storing organisms and, lastly, (3) PHA accumulation. Nowadays, these biological systems are mostly monitored and controlled through offline and time-consuming tools, resulting in time-delayed responses and, therefore, in a loss of process productivity (e.g. due to PHA consumption during its production). In this context, two-dimensional (2D) fluorescence spectroscopy has a high potential to be used as a tool for real-time monitoring and control of bioprocesses. By being a selective, sensitive, non-invasive and non-destructive technique, it is able to acquire the information from the culture broth online, through optical sensors, allowing an early identification of a process disturbance but also the optimum point of each stage (in case of the PHA production by MMCs), towards the highest process productivity. Therefore, this PhD thesis was focused on the valorisation of a by-product from the beer industry (brewer’s spent grain (BSG)) through PHA production, using 2D fluorescence spectroscopy as a support towards the real-time monitoring of the biological systems used. A three-stage PHA production process by MMCs was implemented at lab-scale, using BSG as feedstock, as it is a carbon-rich waste worldwide generated in large volumes. BSG is a lignocellulosic material with a complex and recalcitrant structure, turning essential a pre-treatment before its use for further fermentation processes. Then, the first study performed in this PhD thesis evaluated the impact of different sulfuric acid concentrations (1 to 5% (w/w)) and liquid to solid ratios (6, 8, 10 and 12 g/g) on the BSG acid hydrolysis, in order to obtain fermentable sugars. The highest hydrolysis efficiency of 65% was attained under the hydrolysis carried out at 3% (w/w) of acid concentration and under a liquid to solid ratio of 10 g/g. The BSG hydrolysate obtained was not only rich in sugars, but also in proteins and nitrogen, which is beneficial considering its further use in fermentation processes. The PHA production process through MMCs was firstly assessed regarding the acidogenic fermentation (stage 1), using granular sludge, where pH fluctuations were imposed to study the effect on the fermentation products (FP) profile and on the microbiome composition. Furthermore, 2D fluorescence spectroscopy coupled to chemometric tools was, for the first time, studied for the monitoring of the acidogenic fermentation. Models were developed to predict the FP and soluble protein (SProt) concentrations in the effluent streams. The results demonstrated that the pH fluctuations over the course of the reactor’s continuous operation altered the granules’ microbiome composition, leading to different effluent FP profiles. The 2D fluorescence spectroscopy was able to capture the trend of the data, allowing to predict the FP and SProt concentrations in the effluent with average errors below 0.75 and 0.43 g/L, respectively, within the range of the experimental data concentrations used (0-6.4 and 1.4-6.2 g/L for the FP and SProt concentrations, respectively). Then, the impact of different operating conditions, namely organic loading rate (OLR) (45 and 60 CmmolFP/(L.d) and sludge retention time (SRT) (2 and 4 days) on the performance of the MMCs during culture selection (stage 2) was evaluated using fermented brewer’s spent grain (fBSG) as feedstock. Moreover, the effect of a hibernation period on the culture performance, mimicking a real case scenario of plant shut down, was also assessed. The study of the system dynamics in terms of process productivity and microbiome composition was carried out. Results showed that the reactor’s operation at higher OLR and SRT resulted in the highest PHA process productivity of 3.55 ± 0.8 gPHA/(L.d). The hibernation period, during which the reactor was stopped for 3 months, and the biomass stored at 4 °C, did not affect the biomass as its PHA-synthetizing activity was restored after some weeks. A similar global PHA productivity to the obtained before, using the same operating conditions, was achieved, demonstrating the robustness of the culture and process. The microbiome dynamics along the culture selection revealed that changes in process operating conditions were closely followed by changes on the bacterial community structure and composition. However, the biomass microbiome harboured various well known PHA producing microorganisms, which persisted in the microbiome, albeit at different relative abundances. 2D fluorescence spectroscopy was then assessed for the real-time monitoring of the intracellular PHA content in the selection reactor (stage 2), operated under different conditions and using fBSG as feedstock. The first models were developed to predict the PHA content in phase I (OLR of 45 CmmolFP/(L.d) and SRT of 4 days). This work presented, for the first time, the good correlation for the PHA prediction based on 2D fluorescence spectroscopy, with an average error of ca. 4.0% gPHA/gTS for new predictions, highlighting the potential of this monitoring tool to quantitatively assess the intracellular PHA content without requiring staining agents. Furthermore, it opened the possibility for an online and real-time monitoring of the biopolymer production process. Models based on 2D fluorescence spectroscopy were also developed to predict the PHA content during the culture selection stage (stage 2), where the operating conditions were changed, and in the PHA accumulation stage (stage 3), carried out in a different reactor. Good correlations were also achieved for the prediction of the PHA content along both culture selection and PHA accumulation stages, regardless of the different operating conditions. Similar PHA prediction abilities were achieved by the models developed for each specific operating condition, comparing to the overall model (average errors ca. 4 and 5% gPHA/gTS, respectively). Lastly, the ability of the 2D fluorescence spectroscopy to monitor the PHA content and the cell dry weight (CDW) concentration along a cultivation experiment of a pure culture was also performed, to access the possibility at extending this tool to PHA production processes that are currently implemented at industrial scale. Good results were presented by both models, with average errors for new predictions of 2.8% gPHA/gCDW and 0.8 g/L for the PHA content and CDW concentration, respectively, demonstrating that 2D fluorescence spectroscopy was also able to capture the information about the culture broth of experiments carried out by a pure culture. This PhD thesis highlights the great potential of 2D fluorescence spectroscopy to real-time monitor the biological systems used on PHA production processes. Simultaneously, this thesis also enabled to evaluate the impact of the operating conditions on the PHA production process through MMCs using BSG hydrolysate as feedstock.