Bacterial electrical routes: deciphering extracellular electron transfer pathways in Geobacter

Abstract

As bactérias Geobacter apresentam uma versatilidade respiratória notável, sustentando o seu crescimento através de vários compostos extracelulares, em contraste com os processos respiratórios convencionais que envolvem dadores e aceitadores de eletrões solúveis, o que se reflete num impacto significativo nas aplicações biotecnológicas, como a biorremediação de contaminantes orgânicos e inorgânicos e a produção de bioenergia. Para otimizar estas aplicações, é imperativo compreender o mecanismo de troca de eletrões entre a célula e o ambiente externo, um processo conhecido como transferência extracelular de eletrões (TEE). Os citocromos trihémicos periplasmáticos do tipo c foram identificados como componentes essenciais para a TEE, fazendo a ponte entre as proteínas das membranas interna e externa. Esta Tese centra-se essencialmente no estudo dos citocromos trihémicos de G. metallireducens (Gm) - PpcA, PpcB, PpcC, PpcE e PpcF e de G. sulfurreducens (Gs) - PpcA-E. Os citocromos de Gm foram caracterizados em diferentes graus utilizando técnicas espectroscópicas complementares, nomeadamente UV-visível e RMN, e concluiu-se que as proteínas são estruturalmente homólogas às de Gs. O citocromo PpcF foi estudado em maior detalhe, o que incluiu a determinação das propriedades detalhadas de cada grupo hemo. Os resultados obtidos revelaram que os três hemos apresentam valores de potencial de redução negativos que diferem entre si e são modulados por uma rede de interações redox e redox-Bohr. Além disso, estes valores cobrem uma janela redox funcional menos negativa em comparação com os citocromos trihémicos de Gs, possivelmente associada à capacidade de Gm para oxidar um espetro mais amplo de compostos orgânicos e inorgânicos. Para além disso, a caraterização preliminar do citocromo PpcE revelou propriedades únicas quando comparado com os seus homólogos de Gm e Gs. As espetroscopias de RMN e UV-visível foram também exploradas para monitorizar as interações biomoleculares e as reações de transferência de eletrões envolvendo os citocromos PpcA-E de Gs. Os estudos entre o PpcA e o aceitador de eletrões Fe-NTA mostraram que o aceitador é reduzido pelo citocromo e que a interação é electrostaticamente impulsionada pelos resíduos de lisina positivamente carregados na vizinhança da extremidade mais exposta do heme IV do citocromo. As interações moleculares entre cada par de citocromos mostraram que a interação dentro de cada par é transitória e inespecífica, dando uma resposta à questão, por que razão as bactérias expressam constitutivamente os cinco citocromos (PpcA-E). Assim, foi demonstrado pela primeira vez como estes pequenos citocromos regulam o potencial redox do periplasma de forma que os citocromos da membrana interna, do periplasma e da membrana externa se encontrem num estado de oxidação intermédio, ou seja, sempre prontos a receber e a doar eletrões, assegurando ao mesmo tempo uma transferência fluida de eletrões do citoplasma para o exterior da célula.

Geobacter bacteria exhibit remarkable respiratory versatility, sustaining their growth through several extracellular compounds in contrast to conventional respiratory processes involving soluble electron donors and acceptors, which is reflected in a significantly impact on biotechnological applications such as bioremediation of organic and inorganic contaminants and bioenergy production. To optimize these applications, it is imperative to understand the mechanism of electron exchange between the cell and the external environment, a process known as extracellular electron transfer (EET). Periplasmic c-type triheme cytochromes have been identified as essential components for EET by bridging the inner and outer membrane proteins. This Thesis focusses mainly on the study of triheme cytochromes from G. metallireducens (Gm) – PpcA, PpcB, PpcC, PpcE and PpcF and G. sulfurreducens (Gs) – PpcA-E. The cytochromes from Gm were characterized at different extent using complementary spectroscopic techniques, namely by UV-visible and NMR. It was concluded that the proteins are structural homologous to those of Gs. Cytochrome PpcF was studied in more detail, including the determination of the detailed properties of each heme group. The results obtained revealed that the three hemes exhibit negative reduction potential values that differ from each other and are modulated by a network of redox and redox-Bohr interactions. Furthermore, these values cover a less negative working functional redox window compared to the triheme cytochromes from Gs, possibly associated with Gm's capacity to oxidize a broader spectrum of organic and inorganic compounds. Furthermore, the preliminary characterization of cytochrome PpcE revealed unique properties when compared to its homologues from Gm and Gs. NMR and UV-visible were also explored to monitor biomolecular interactions and electron transfer reactions involving the well characterized PpcA-E cytochromes from Gs. Studies between PpcA and the electron acceptor Fe-NTA showed that the acceptor is reduced by the cytochrome and that the interaction is electrostatically driven by the positively charged lysine residues in the vicinity of the most exposed edge of cytochrome’s heme IV. Molecular interactions between each pair of cytochromes showed that the interaction within each pair is transient and unspecific, providing an answer to the question, why the bacteria express constitutively the five cytochromes (PpcA-E). In fact, it was showed for the first time how these small cytochromes regulate the redox potential of the periplasm in a way that the inner membrane, periplasmic and outer membrane cytochromes are at an intermediate oxidation state, i.e., always ready to receive and donate electrons, while assuring a smooth electron transfer from the cytoplasm to the cell exterior.