Implementation of an Ex Vivo Retinal Organotypic Culture model to study Age-Related Macular Degeneration

Abstract

The complex structure of the eye contributes to the fact the many retinal diseases have unclear pathogenesis, including age-related macular degeneration (AMD). Without elucidating the mechanism of disease development, it is not possible to define the ideal therapeutic target. In AMD currently available therapeutic options are often unsatisfactory. There are no perfect models to study AMD. Over the years, researchers used different models, such as: cell lines, primary cell cultures. To maintain the cellular interactions, 3D models are used such as organoids, organotypic retinal cultures, and animal models. However, all of them have advantages and limitations. This project aimed to develop an organotypic retinal culture model that accurately preserved the anatomical characteristics and cellular connections in the in vivo retina. The porcine and human retinas have similar anatomical features, which makes the porcine neuroretina a suitable model for studying mechanisms of neurodegenerative disease of human retina. Porcine neuroretina were harvested and placed in a culture insert. Two conditions were performed: a) the standard method with only neuroretina with photoreceptors facing down the insert and b) the whole posterior structure of the eye, including the neuroretina, retinal pigment epithelium, Brush´s membrane, choroid, and sclera. The explants were assessed fresh and after 2, 4, 6, and 8 days in culture using hematoxylin-eosin stain for morphology evaluation and immunohistochemistry for glial activation, preservation of photoreceptors, and bipolar cells evaluation. Although samples containing only neuroretina were insufficient for a proper comparative analysis, samples containing the entire posterior segment remained viable for 8 days in culture, maintaining the anatomic morphology without thinning the retinal laminar layers. Glial activity remained stable throughout the culture period, and bipolar cells were preserved. Photoreceptors are highly sensitive to stress and show a reduction over time. Although they were better preserved at the beginning of culture compared to samples containing only neuroretina, a more detailed analysis could not be conducted due to the difficulty in reproducing cultures containing only neuroretina. Further studies are necessary for improve and validate this model. However, in the retinal organotypic culture the entire structure of the posterior segment of the eye may serve as a more suitable and reproducible ex vivo method to study AMD pathogenesis and explore new therapeutic approaches.

A complexa estrutura do olho contribui para o facto de muitas doenças da retina terem patogénese não elucidada, incluindo na degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Sem a elucidação dos mecanismos que resultam no desenvolvimento da doença, não é possível definir o alvo terapêutico. Na DMRI, as opções terapêuticas atualmente disponíveis são frequentemente insatisfatórias. Não existem modelos perfeitos para estudar a DMRI. Ao longo dos anos, os investigadores usaram diferentes sistemas como: linhas celulares, culturas celulares primárias. De forma a preservar as interações celulares, modelos 3D podem ser usados como por exemplo os organoides, as culturas organotípicas da retina e os modelos animais. No entanto, todos eles têm vantagens e limitações. Este projeto teve como objetivo desenvolver um modelo de cultura organotípica da retina que preservou com precisão as características anatômicas e conexões celulares na retina in vivo. As retinas suínas e humanas possuem características anatômicas semelhantes. O que torna a neurorretina suína um modelo adequado para estudar mecanismos de doença neurodegerativa da retina humana. A neurorretina suína foi colhida e colocada em um inserto de cultura. Foram usadas duas comdições experimentais: a) o método padrão com apenas neurorretina com fotorreceptores voltados para baixo e b) toda a estrutura posterior do olho, incluindo a neurorretina, epitélio pigmentar da retina, membrana de Brush, coróide e esclera. Os explantes foram avaliados frescos e após 2, 4, 6 e 8 dias em cultura, utilizando coloração hematoxilina-eosina para avaliação morfológica, e imunohistoquímica para ativação glial, preservação de fotorreceptores e avaliação de células bipolares. Embora as amostras contendo apenas neurorretina tenham sido insuficientes para uma análise comparativa adequada, as amostras contendo todo o segmento posterior permaneceram viáveis por 8 dias em cultura, mantendo a morfologia anatómica sem estreitar as camadas laminares da retina. A atividade glial permaneceu estável durante todo o período de cultura e as células bipolares foram preservadas. Os fotorreceptores são altamente sensíveis ao stress e apresentam uma redução ao longo do tempo. Embora estivessem mais bem preservadas no início da cultura em comparação com amostras contendo apenas neurorretina, uma análise mais detalhada não pôde ser realizada devido à dificuldade em reproduzir culturas contendo apenas neurorretina. Mais estudos são necessários para melhorar e validar este modelo. No entanto, na cultura organotípica da retina, toda a estrutura do segmento posterior do olho pode servir como um método ex vivo mais adequado e reprodutível para estudar a patogénese da DMRI e explorar novas abordagens terapêuticas.