Caracterização do transcritoma de Staphylococcus aureus ATCC® 25923™ exposto à clorexidina

Abstract

RESUMO A espécie Staphylococcus aureus é um agente patogénico relevante no Homem e em animais de companhia, em particular gatos e cães, sendo um agente frequente de infeções da pele e tecidos moles. A terapêutica destas infeções na medicina humana e veterinária envolve o recurso a biocidas de uso tópico (antissépticos). A resistência aos antimicrobianos em S. aureus é uma ameaça global com consequências devastadoras a nível da escassez de recursos terapêuticos para a população humana e animal. O uso intensivo de biocidas na prática clínica humana e veterinária pode também exercer uma pressão adicional para a emergência da resistência. No entanto, o modo de ação e mecanismos de resistência aos biocidas são ainda pouco conhecidos. De forma a compreender melhor o mecanismo de ação da clorexidina e de emergência de suscetibilidade reduzida a este biocida, o presente trabalho teve como objetivo identificar as vias metabólicas e os genes diferencialmente expressos em S. aureus exposto à clorexidina e ao brometo de etídeo, ambos substratos de bombas de efluxo em estafilococos. Para isso, os objetivos específicos foram: 1) Exposição, por ensaios time-kill, da estirpe S. aureus ATCC® 25923™ a diferentes concentrações de clorexidina e tempos de exposição, comparando a sua atividade com a de dois outros biocidas, iodopovidona e cloreto de benzalcónio; 2) Sequenciação de RNA total de S. aureus ATCC® 25923™ não exposto e exposto à clorexidina; 3) Análise do transcritoma usando ferramentas bioinformáticas e identificação de genes e vias metabólicas ativadas pela exposição à clorexidina e ao brometo de etídeo. A exposição à clorexidina e ao brometo de etídeo alterou a expressão de genes cujos produtos participam nas seguintes funções moleculares: a) atividade catalítica, b) ligação, c) transportador, d) regulador da transcrição, e) atividade dependente do ATP (Trifosfato de adenosina), f) atividade estrutural da molécula, e g) atividade de tradução molecular. Além disso, a exposição à clorexidina e ao brometo de etídeo favorece uma sobre-representação da via da biossíntese de purinas em S. aureus ATCC® 25923™, quando comparadas com o esperado para a estirpe homóloga S. aureus NCTC 8325. No caso específico da exposição ao brometo de etídeo, foi também possível identificar sobre representação das vias da biossíntese de pirimidinas e da biossíntese de triptofano, quando comparada com a estirpe homóloga. Este estudo traz novo conhecimento sobre as vias celulares alteradas após exposição de S. aureus ATCC® 25923™ à clorexidina, um biocida usado comummente em medicina humana e animal. Este conhecimento pode conduzir a uma melhor compreensão de como S. aureus responde e persiste na presença do estresse originado por clorexidina.

ABSTRACT Staphylococcus aureus is a relevant pathogen in humans and in companion animals, particularly cats and dogs and is a frequent agent of skin and soft tissue infections. The therapy of these infections in human and veterinary medicine involves the use of topical biocides (antiseptics). Antimicrobial resistance in S. aureus is a global threat with devastating consequences on the scarcity of therapeutic resources for the human and animal population. The intensive use of biocides in human and veterinary clinical practice may exert additional pressure for the emergence of antimicrobial resistance. However, the mode of action and resistance mechanisms to biocides is still poorly understood. In order to better understand the mechanism of action of chlorhexidine and gain insight into emergence of resistance to this biocide, the present work aimed to identify the metabolic pathways and genes differentially expressed in S. aureus due to exposure to chlorhexidine and ethidium bromide, both efflux pump substrates in staphylococci. For this, the following steps were performed: 1) Exposure of S. aureus ATCC® 25923™ strain to different concentrations of chlorhexidine and exposure times, comparing its bactericidal activity with two other biocides, iodopovidone and benzalkonium chloride; 2) RNA sequencing of S. aureus ATCC® 25923™ non-exposed and exposed to chlorhexidine; 3) Analysis of the transcriptome using bioinformatics tools and identification of genes and metabolic pathways activated by exposure to chlorhexidine and ethidium bromide. Exposure to both chlorhexidine and ethidium bromide altered the expression of genes whose products participate in the following molecular functions: (a) catalytic activity, (b) binding, c) transporter, d) regulator of transcription, e) ATP-dependent activity (adenosine triphosphate), f) structural activity of the molecule and g) molecular translation activity. Furthermore, both chlorhexidine and ethidium bromide exposure favored the over-representation of the purine biosynthesis pathway in the S. aureus ATCC® 25923™ strain, when compared to what was expected for a homologous strain, S. aureus NCTC 8325. In the specific case of ethidium bromide, it was also possible to identify over-representation of the pyrimidine biosynthesis and tryptophan biosynthesis pathways, when compared to the homologous strain. This study brings new knowledge on the cellular pathways that are altered upon S. aureus exposure to a chlorhexidine, a biocide commonly used in human and animal medicine. This knowledge may pave the way for our understanding on how S. aureus may cope and persist in the presence of chlorhexidine stress