Avaliação da suscetibilidade a antibióticos de isolados ambientais de Legionella spp. identificados em Portugal

Abstract

A Doença dos Legionários é uma pneumonia causada por bactérias do género Legionella das quais se destaca Legionella pneumophila. Estas bactérias são ubíquas em sistemas aquáticos naturais e artificiais sendo que a infeção é adquirida através de aerossóis disseminado a partir de uma fonte contaminada . Dado que vários casos de resistência têm sido reportados e que os isolados portugueses ambientais de Legionella estão fracamente caracterizados, o objetivo deste estudo foi descrever os padrões de suscetibilidade destes, bem como avaliar a presença de mecanismos de resistência aos principais antibióticos usados no tratamento desta patologia, estudar o comportamento de estirpes resistentes na ausência de pressão seletiva de antibióticos e determinar a influência que concentrações sub-inibitórias, alcançáveis em ecossistemas, naturais poderão ter no desenvolvimento de resistências. Os padrões de suscetibilidade de 57 isolados ambientais de Legionella foram caracterizados através do método de microdiluição em meio líquido para os antibióticos azitromicina, claritromicina, ciprofloxacina, levofloxacina e doxiciclina. A presença de mecanismos de resistência foi determinada através da amplificação por PCR dos genes lpeAB, tet56 e gyrA. Para analisar o comportamento de estirpes resistentes, previamente produzidas em laboratório no decurso do presente estudo, estas foram passadas na ausência de qualquer antibiótico. Para avaliar a influência dos antibióticos em concentrações sub-inibitórias, duas estirpes foram passadas sucessivamente durante, no máximo 20 passagens à concentração mínima seletiva. A distribuição de MICs é similar ao descrito na literatura apesar de os valores obtidos superarem a distribuição de referência do EUCAST. As fluoroquinolonas obtiveram as menores MICs, seguidas pela claritromicina e a azitromicina, que apresentou valores relativamente elevados. A doxiciclina foi o antibiótico que apresentou as MICs mais elevadas. Durante este estudo foram detetados dois isolados, IST2 e IST24, que apresentaram resistência às duas fluoroquinolonas, o isolado IST24 apresentou ainda resistência a todos os antibióticos estudados. As MIC elevadas para azitromicina são explicadas pela ampla presença do gene lpeAB, reportado em 59% dos isolados cujas MIC superou os valores de referência do EUCAST. O gene tet56 foi detetado pela primeira vez numa L. anisa. A análise das regiões relevantes do gene gyrA não revelou nenhuma mutação que fosse responsável pela resistência dos isolados IST2 e IST24. Observou-se que as estirpes resistentes desenvolvidas durante o estudo tendem a não reverter na totalidade para o fenótipo suscetível uma vez retirada a pressão seletiva do antibiótico, uma das duas estirpes demonstrou perda incompleta de resistência para apenas um dos dois antibióticos estudados. Relativamente à influência exercida pelas concentrações sub inibitórias de antibióticos, os ensaios revelaram que das duas das estirpes uma desenvolveu um MICs 32x e 64x vezes superiores aos valores iniciais, à azitromicina e levofloxacina, respetivamente. Os nossos resultados revelam a existência de Legionella ambientais resistentes e multirresistentes, tornando imperativo a monitorização dos padrões de suscetibilidade e ao rápido estabelecimento de um método de teste gold standard, bem como de valores de referência para os ECOFFs.

Legionnaires’ Disease is a pneumonia caused by members of the Legionella genra, in particular, Legionella pneumophila. These bacteria are ubiquitous in water systems, natural or man-made, and the infection is usually acquired through aerosols of environmental origin. Given the previous reports of resistance in these bacteria, and the poor characterization of Portuguese environmental isolates in this study we aim to describe the susceptibility patterns of such, evaluate the presence of resistance mechanisms of the main antibiotics in the treatment of this disease, analyze the behavior of resistant strains in the absence of particular antibiotics and to determine the influence of sub-inhibitory concentrations of antibiotic, reachable in the environment, in resistance development. The susceptibility patterns of 57 environmental Legionella isolates were characterized through broth microdilution for azithromycin, clarithromycin, ciprofloxacin, levofloxacin, and doxycycline. Presence of resistance mechanisms was determined by PCR amplification of genes lpeAB, tet56, and gyrA sequencing. Behavior of resistant strains was analyzed by successive passages in non-selective media. To evaluate influence of sub-inhibitory concentrations of antibiotics, two strains were successively passed at minimal selective concentration. Our MIC distribution is supported by previous reports despite surpassing the current EUCAST reference distribution. Fluoroquinolones obtained the lowest MIC values, followed by clarithromycin and azithromycin, whose MIC values were elevated. Doxycycline presented the highest MIC values. Two isolates, IST2 and IST24 presented resistance to both fluoroquinolones and isolate IST24 presented resistance to all antibiotics studied. The elevated azithromycin MICs are explained by the wide lpeAB presence, who was reported in 59% of all isolates whose MIC surpassed the EUCAST reference values. The tet56 gene was unprecedently detected in a L. anisa isolate. The analysis of relevant regions of the gyrA gene did not reveal any mutation responsible for the resistance presented by isolates IST2 and IST24. The resistant strains here developed did not fully revert to a susceptible phenotype once the selective pressure of the antibiotic was removed, only one of the two strains demonstrated incomplete resistance loss for only one of the two antibiotics studied. Regarding the influence of sub-inhibitory concentrations, of the two tested strains, one developed MIC values 32x and 64x higher than initial values, to azithromycin and levofloxacin, respectively. Our finding supportsthe possibility of development of resistant and multirresistant Legionella in the environment, highlighting the necessity of susceptibility pattern monitorization as well as the establishment of a testing gold standard, reference ECOFF values and clinical breakpoints.