The role of the RhoGEF protein Solo in Src regulation in triple-negative breast cancer

Abstract

O cancro da mama triplo-negativo (TNBC) é o mais agressivo subgrupo de cancro da mama (BC), associado a uma elevada chance de metastização. Para que a metastização possa ocorrer, migração celular é necessária. Este processo é dependente de adesões focais (FAs), cruciais para a ancoragem e para a comunicação da célula com a matriz extracelular (ECM), e do citoesqueleto de actina, que é fortemente regulado por Rho GTPases. A proteína RhoGEF Solo foi observada estar sobreexpressa em células TNBC e a sua depleção resultar numa diminuição em motilidade celular. Adicionalmente, Solo foi recentemente descoberta como sendo reguladora de RhoB em membranas endossomais em células HeLa. Além disto, RhoB está associada com o tráfego de proteínas sinalizadoras em endossomas entre a região peri-nuclear e a periferia celular. Uma destas proteínas é a quinase Src, uma das principais proteínas das FAs, frequentemente sobreexpressa em células TNBC. Curiosamente, dados do nosso laboratório revelaram Solo como sendo fosforilada por Src mas uma função não foi ainda identificada. Para além disto, o papel de Solo no tráfego de Src ainda não foi descrito. O objetivo desta tese foi estudar os efeitos do knock down de Solo no tráfego de Src e no desenvolvimento de FAs por imunofluorescência. Para isto, as linhas celulares MDA MB-231 e BT549 foram selecionadas enquanto sistemas modelo. Células shSolo MDA MB-231estáveis induzidas por doxiciclina foram também geradas. Curiosamente, foi possível observar que ambos os knock down transiente e estável de Solo resultaram na acumulação de Src na região subcelular peri-nuclear e na redução da atividade de Src em células shSolo MDA-MB-231. Células shSolo apresentaram FAs mais longas e níveis de fosfotirosina reduzidos na periferia celular. Adicionalmente, os níveis de fosfotirosina do efetor downstream de Src, Paxilina, foi observado como estando diminuídos nas FAs, mesmo que um aumento global na fosforilação de Paxilina tenha sido quantificado. Numa matriz 3D, agrupamentos de células shSolo MDA-MB-231mostraram uma diminuição dos níveis de Src assim como menos Src extracelular. Em suma, estes resultados sugerem que Solo afeta o tráfego de Src entre as região peri-nuclear e a periferia celular. No futuro, considerando que ambas as proteínas Solo e Src estão conectadas com endossomas RhoB-positivos, seria relevante identificar outras vias que poderão ser afetadas por este eixo. Adicionalmente, as linhas celulares BT549 e HS578T poderão ser usados como modelos para ensaios adicionais de forma a compreender se os efeitos observados nesta tese são conservados em diferentes linhas celulares de TNBC. Em resumo, detalhar a base subjacente do papel de Solo em TNBC é essencial para compreender o seu fenótipo agressivo e para o desenvolvimento de tratamentos futuros.

Triple-negative breast cancer (TNBC) is the most aggressive subgroup of breast cancer (BC), associated with an increased likelihood of metastasis. So that metastasis can occur, cell migration is necessary. This process is dependent on focal adhesions (FAs), that are crucial for cell anchorage and communication with the extracellular matrix (ECM), and the actin cytoskeleton, which is tightly regulated by Rho GTPases. The RhoGEF protein Solo was found to be overexpressed in TNBC cells and its depletion to result in decreased cell motility. Furthermore, Solo was also discovered to regulate RhoB at endosomal membranes in HeLa cells. RhoB is associated with endosomal trafficking of signaling proteins between the perinuclear region and the cell periphery. One of such proteins is the kinase Src, one of the main FA proteins, frequently overexpressed and overactive in TNBC cells. Interestingly, data from our lab revealed Solo to be phosphorylated by Src but a function has not yet been identified. Besides, the involvement of Solo in Src trafficking has not yet been described. The aim of this thesis was to study the effects of Solo knock down on Src trafficking and FAs development by immunofluorescence. To this end, the MDA-MB-231 and BT549 cell lines were selected as model systems. Stable doxycycline-induced shSolo MDA-MB 231 cells were also generated. Strikingly, it could be shown that both transient and stable Solo knock down resulted in an accumulation of Src at the perinuclear subcellular region and decreased Src activity in shSolo MDA-MB-231 cells. shSolo cells showed longer FAs and decreased phosphotyrosine levels at the cell periphery. Additionally, the phosphorylation levels of the Src downstream effector Paxillin was also observed to be decreased at the FAs, even though an overall increase in Paxillin phosphorylation was quantified. In a 3D matrix, shSolo MDA-MB-231 cell spheroids showed a decrease in Src levels as well as less extracellular Src. Together, these results suggest that Solo affects Src trafficking in between the perinuclear region and the cell periphery. For the future, as both Solo and Src are connected to RhoB-positive endosomes, it would be interesting to identify other pathways that could be affected by this axis. Additionally, BT549 and HS578T cell lines could be used as models in further experiments to understand if the effects observed in this thesis are conserved in different TNBC cell lines. In short, detailing the underlying basis of the role of Solo in TNBC is essential for understanding its aggressive phenotype and for the development of future treatments.