Sacsin deletion disrupts Golgi organization and Autophagy in C6 rat glioblastoma cells

Abstract

Autosomal recessive spastic ataxia of Charlevoix-Saguenay (ARSACS) is a rare childhood-onset ataxia characterized by progressive cerebellar ataxia, spasticity, motor sensory neuropathy and axonal demyelination. ARSACS is caused by mutations in the SACS gene, which leads to the production of defective forms of the 520 kDa multidomain protein sacsin. C6 rat glioblastoma cells were targeted for sacsin deletion by means of CRISPR/Cas9 technique to generate an astroglial model of ARSACS. Sacsin knockout cell lines were isolated by Flow Cytometry-assisted Cell Sorting and sacsin loss was subsequently confirmed in further experiments. Intermediate filaments (IF) expression levels were analyzed upon serum starvation and incubation with IL-6 and BMP2 cytokines, while IF aggregation and their disruption on organelle organization was observed by immunocytochemistry. C6 SACS-/- cells revealed an increase in expression of IF proteins and aggregation of nestin in the juxtanuclear area. Golgi apparatus was often pushed out of the perinuclear area and disarrayed in SACS-/- cells. STAT3 and SMAD1/5 signalling was altered in C6 SACS-/- cells in response to cytokines. The expression of the alarmin protein S100B was significantly higher in C6 SACS-/- cells. The expression of the cytosolic form of the autophagy protein LC3-I was identical in both cells lines but the levels of the activated LC3-II form was reduced in C6 SACS-/- cells, indicating alterations in the autophagy flux. ER stress pathways were also analyzed for possible novel phenotypes in ARSACS cells. The expression of the Unfolded Protein Response (UPR)-related protein Bip did not differ for both C6 strains. CHOP had an increased expression in reference C6 cells in normal conditions but was unexpectedly not expressed in conditions of serum starvation. Withaferin A (WFA), a drug known to bind and disorganize the type III IF vimentin, disrupted Nestin filaments and induced Golgi dispersion similar to C6 SACS-/- cells. In conclusion, lack of sacsin protein disrupts glial intermediate filament assembly and intracellular organelle distribution, enhances S100B expression and impairs autophagy, while being inconclusive regarding ER stress. These results suggest a potential function for sacsin in glial cells and may have implications for treating ARSACS as well as a variety of human illnesses caused by the disruption of intermediate filament networks.

A ataxia espática autossómica recessiva de Charlevoix-Saguenay (ARSACS) é uma ataxia rara com início na infância caracterizada por ataxia cerebelar progressiva, espasticidade, neuropatia sensório-motora e desmielinização axonal. ARSACS é causada por mutações no gene SACS, que leva à truncação da proteína sacsina multidomínio de 520 kDa. Células C6 de glioblastoma de rato foram selecionadas para deleção de sacsina através da técnica de CRISPR/Cas9 para produzir modelos de ARSACS de astroglia. Linhas celulares de knockout de sacsina foram isoladas através de Citometria de Fluxo-assisted Cell Sorting e a perda de sacsina foi posteriormente confirmada. Os níveis de expressão e a organização de filamentos intermédios (IF) foram analisados em condições de inanição de nutrientes e indução de citoquinas IL-6 e BMP2, enquanto a agregação de IF e a consequente disrupção da organização dos organelos foi observado por imunocitoquímica. Expressão elevada de proteínas de IF e agregação de nestina na posição juxtanuclear rodeado de Golgi disperso foi revelada em células C6 SACS-/-. A sinalização de STAT3 e SMAD1/5 demonstrou alterado em células C6 SACS-/-. A expressão da alarmina S100B revelou-se significativamente elevada nas células SACS-/-. A expressão da LC3-I citosólico foi idêntica em ambas linhas celulares, mas a forma ativada LC3-II presente em autofagosomas encontrou-se reduzido nas células C6 SACS-/-, revelando alterações no fluxo autofágico. Stress de ER foi analisado para possíveis fenótipos em modelos celulares ARSACS. A expressão de Bip relacionada com Resposta de Proteína Desdobrada (UPR) não diferiu em ambas linhas celulares. A expressão da proteína CHOP é superior em C6 controlo em condições normais, mas não foi expressa em testes de inanição. Withaferina A (WFA), uma droga conhecida por se ligar e desorganizar a proteína IF tipo III vimentina, perturbou os filamentos de Nestin e induziu a dispersão de Golgi, fenótipos semelhantes a modelos celulares ARSACS. Concluindo, a falta de sacsina causa a disrupção de IF em células gliais e na organização de organelos intracelulares, aumenta a expressão da S100B e prejudica a autofagia, apesar de ser inconclusivo no que diz respeito à neuroinflamação e ao stress ER. Estes resultados sugerem uma função potencial para a sacsina em células glial e podem ter implicações no tratamento de ARSACS, bem como uma variedade de doenças humanas causadas pela perturbação das redes de filamentos intermédios.