Engineering and characterization of novel denaturing platforms for automated release of miRNA from carrier proteins and exosomes

Abstract

A transição de miRNAs provenientes de biópsias líquidas em biomarcadores para dispositivos de point-of-care (POC) tem sido limitada devido aos passos de pré-processamento necessários para a análise de amostras. A ambiguidade na literatura relativamente à sua biogénese prejudica a deteção e standardização dos protocolos de extração de miRNAs. Aqui, moléculas derivadas de guanidina foram produzidas para agir como poderosos agentes denaturantes, permitindo a libertação de miRNAs dos portadores. Estas moléculas foram então acopoladas a hidrogéis e a partículas magnéticas, permitindo a construção de dois mecanismos de extração de miRNA diferentes. As matrizes de hidrogéis funcionalizadas desnaturaram com sucesso as proteínas e enalteceram as propriedades desnaturantes das moléculas de guanidina acopladas, devido à estrutura tridimensional intrínseca. Da mesma forma, o mecanismo de desnaturação composto por partículas magnéticas induziu a desnaturação de proteínas e foi ainda testado para a libertação de miRNA a partir de amostras de plasma. Este método de extração exigiu menos etapas de processamento e reduziu a utilização de reagentes tóxicos. O qPCR foi utilizado para quantificar a concentração de miR-21 após a extração, mostrando que foram extraídas baixas concentrações deste miRNA com a utilização dos MBs. Os sistemas de desnaturação aqui estudados podem ajudar a contribuir para a standardização da extração de miRNA, assim como incentivar novos dispositivos POC com libertação de miRNA on- chip, promovendo a utilização de miRNAs provinientes de biópsias líquidas como biomarcadores.

Translation of miRNAs from liquid biopsies into biomarkers for point-of-care (POC) devices has been limited due to the pre-processing steps needed for sample analysis. The ambiguity in literature regarding its biogenesis impairs miRNA detection and standardization of extraction protocols. Herein, guanidine derived molecules were produced to act as powerful denaturing agents, enabling miRNA release from carriers. This molecules were then coupled to hydrogels and magnetic beads (MBs), allowing to construct two different miRNA extraction mechanisms. The functionalized hydrogel matrixes successfully unfolded proteins and enhanced the denaturing properties of the coupled guanidine molecules, due to their intrinsic three-dimensional network. Similarly, the MBs denaturing mechanism induced protein unfolding and it was further tested for miRNA release from plasma samples. This extraction method required less processing steps and reduced the usage of toxic reagents. The qPCR was used to quantify the miR-21 concentration post extraction, showing that low quantities of this miRNA were extracted when using the MBs. The denaturing systems here studied can help contribute towards the standardization of miRNA extraction was well as encourage new POC devices with on-chip miRNA release, to further promote the use of miRNAs from liquid biopsies as biomarkers.