Expression and Characterisation of Cysteine-Rich Secretory Proteins in a Marine Gastropod

Abstract

Cysteine-rich secretory proteins (CRISPs) are highly bioactive natural products, bearing potential biotechnological and biomedical applications, from anti-oxidants to biocides. They can be found in a wide range of organisms, with emphasis on venom-secreting animals. Still, little is known about CRISPs in marine invertebrates despite their immense biodiversity and relevance for the bioprospecting for novel natural products. These proteins play important roles in many organs, from digestion to toxins for preying and defence against predators and competitors. Even though venoms, such as those secreted by marine cone snails, contain some of the best-studied cysteine-rich toxins, and indeed already giving rise to approved painkiller drugs, most marine invertebrate venoms remain uncharacterized, as well as their individual components. Nucella lapillus (L. 1758) is a common gastropod in W Europe that is suspected to secrete immobiliser toxins related to cysteine-rich proteins. The present work aimed at comparing the secretion, presence and bioreactivity of cysteine-rich proteins between foot, salivary gland, digestive gland and gonad. Histological results demonstrate that the salivary gland is structurally compatible with the secretion of enzymes and toxins. The salivary gland still contains the highest amount and diversity of proteins, with the largest fraction within 20-40 kDa, which is compatible with the proteins under study. In turn, isolating proteins from digestive gland and gonads was problematic, in large part due to the presence of peptidases. However, it was in these organs that the highest content of thiols was found. Ex-vivo bioassays with mussel gills revealed the bioreactivity of protein extracts from the salivary gland and foot, their secretions caused some morphological changes, such as increased haemocytes and apoptosis. These results indicate that these two organs are a promising target for bioprospecting.

As proteínas secretoras ricas em cisteína (CRISPs) são produtos naturais altamente bioativos, com potenciais aplicações biotecnológicas e biomédicas, de antioxidantes a biocidas. Podem ser encontradas em diversos organismos, com ênfase nos animais secretores de veneno. Ainda assim, pouco se sabe sobre CRISPs em invertebrados marinhos, apesar da sua grande biodiversidade e relevância para a bioprospecção de novos produtos naturais. Essas proteínas desempenham papéis importantes em muitos órgãos, desde a digestão até toxinas para ataque e defesa contra predadores e competidores. Embora os venenos, como os secretados por caracóis marinhos, contenham algumas das toxinas ricas em cisteína mais estudadas e, na verdade, já deram origem a medicamentos analgésicos aprovados, a maioria dos venenos de invertebrados marinhos permanece descaracterizada, assim como os seus componentes individuais. Nucella lapillus (L. 1758) é um gastrópode comum no oeste da Europa, suspeito de secretar toxinas imobilizadoras relacionadas com as proteínas ricas em cisteína. O presente trabalho teve como objetivo comparar a secreção, presença e bioreatividade de proteínas ricas em cisteína entre pé, glândula salivar, glândula digestiva e gônada. Os resultados histológicos demonstram que a glândula salivar é estruturalmente compatível com a secreção de enzimas e toxinas. A glândula salivar contém ainda a maior quantidade e diversidade de proteínas, com a maior fração entre 20-40 kDa, o que é compatível com as proteínas em estudo. Por outro lado, isolar proteínas da glândula digestiva e gônadas revelouse problemático, em grande parte devido à presença de peptidases. No entanto, foram nestes órgãos que se encontraram o maior teor de tióis. Os bioensaios ex-vivo com a brânquia dos mexilhões revelaram a bioreatividade de extratos proteicos da glândula salivar e do pé, as suas secreções causaram algumas alterações morfológicas, como o aumento de hemócitos e de apoptoses. Esses resultados indicam que esses dois órgãos são um alvo promissor para bioprospecção.