Estudo do efluxo e de outros mecanismos na resistência a fluoroquinolonas em Staphylococcus pseudintermedius

Abstract

Staphylococcus pseudintermedius é uma bactéria colonizadora da pele e mucosas do cão, podendo ser também encontrada em gatos. Esta bactéria é o principal agente etiológico do pioderma superficial bacteriano canino e uma das principais causas para tratamento sistémico com recurso a antibióticos em animais de companhia. Este trabalho teve como principal objetivo estudar a atividade de efluxo em S. pseudintermedius e a sua relevância na resistência a compostos antimicrobianos efluxáveis como as fluoroquinolonas, utilizando o brometo de etídeo (EtBr) como marcador indireto da atividade de efluxo. Estudou-se um conjunto de 52 S. pseudintermedius, associados a infeções da pele e dos tecidos moles (SSTIs) em cães e gatos, isolados em dois laboratórios de diagnóstico veterinário do distrito de Lisboa, Portugal. Numa primeira abordagem, foi determinada a concentração mínima inibitória (CMI) para o EtBr e a distribuição deste valor utilizada para definir o valor de cut-off (COWT) possibilitando a separação da população wild-type (WT) e non wild-type (NWT) para este composto. Estabeleceu-se um COWT de 8 mg/L e a aplicação deste valor à coleção em estudo indicou a inexistência de uma população NWT para o EtBr. Posteriormente, a CMIEtBr foi determinada na presença dos inibidores de efluxo (IEs) verapamil e tioridazina. Estes IEs promoveram uma redução da CMIEtBr, sugerindo a presença de atividade de efluxo nestes isolados. A pesquisa dos genes plasmídicos qacA/B e smr, que codificam para bombas de efluxo MDR com capacidade para extrusar compostos como o EtBr, foi realizada no grupo de 52 isolados tendo-se posteriormente estendido a toda a coleção de 157 S. pseudintermedius disponível, não se tendo encontrado nenhum dos genes. Numa segunda abordagem, e porque o efluxo tem sido implicado na resistência a fluoroquinolonas (FQ) noutras espécies de estafilococos, determinou-se a CMI da ciprofloxacina (CMICIP) na presença e ausência dos mesmos compostos IEs. Os valores obtidos para a CMICIP variaram entre 0,06-64 mg/L. Na presença dos dois IEs apenas se verificou diminuição significativa da CMICIP em três isolados, todos eles suscetíveis à CIP e à meticilina. Esta aparente ausência de efluxo pode estar encoberta pela presença de mutações nas zonas quinolone-resistance determining region (QRDR) dos genes alvo grlA e gyrA. Estas mutações foram pesquisadas para 42 isolados dos 52 em estudo, revelando que 27 apresentam pelo menos uma mutação QRDR. Todas estas mutações já tinham sido previamente descritas, com exceção da mutação Asp83Asn de GyrA, identificada pela primeira vez neste trabalho para S. pseudintermedius. Assim, verificou-se que a resistência a FQ nesta batéria ocorre maioritariamente por mutações nos genes alvo. Verificou-se ainda a presença de atividade de efluxo basal, revelando o potencial de emergência de resistências pela exposição a estes antibióticos através da ativação de sistemas de efluxo. Os resultados obtidos nesta Dissertação refletem a necessidade de uma abordagem Uma Só Saúde, que reconhece a importância de uma visão global da saúde humana, animal e do meio ambiente para uma resposta adequada e eficaz aos principais desafios de saúde na atualidade, como é a resistência aos antimicrobianos.

Staphylococcus pseudintermedius is a bacterium that colonizes the skin and mucous membranes of dogs and can also be found in cats. This bacterium is the main etiological agent of superficial bacterial canine pyoderma and one of the main causes for systemic treatment using antibiotics in companion animals. The main objective of this work was to study the efflux activity in S. pseudintermedius and its relevance in the resistance to effluxable antimicrobial compounds such as fluoroquinolones, using ethidium bromide (EtBr) as an indirect marker of efflux activity. A set of 52 S. pseudintermedius, associated with skin and soft tissue infections (SSTIs) in dogs and cats, isolated at two veterinary diagnostic laboratories in the district of Lisbon, Portugal, was studied. In a first approach, the minimum inhibitory concentration (MIC) for EtBr was determined and the distribution of this value used to define the cut-off value (COWT) enabling the separation of the wild-type (WT) and non wild-type (NWT) population for this compound. A COWT value of 8 mg/L was established and the application of this value to the collection under study indicated the inexistence of an NWT population for EtBr. Subsequently, CMIEtBr was determined in the presence of the compounds verapamil and thioridazine, known as efflux inhibitors (EIs). These EIs promoted a reduction in CMIEtBr, suggesting the presence of efflux activity in these isolates. The search for plasmid genes qacA/B and smr, encoding MDR efflux pumps with the capacity to extrude compounds such as EtBr, was carried out in a group of 52 isolates and was later extended to the entire collection of 157 isolates of S. pseudintermedius available at the host laboratory. None of the genes were found. In a second approach, and because efflux has been implicated in fluoroquinolone (FQ) resistance in other staphylococcal species, ciprofloxacin MIC (CMICIP) was determined in the presence and absence of the same EIs. The values obtained for CMICIP ranged between 0.06-64 mg/L. In the presence of the two EIs, there was only a significant decrease in CMICIP in three isolates, all of them susceptible to CIP and methicillin (MSSP). This apparent absence of efflux may be overshadowed by the presence of mutations in the quinolone-resistance determining region (QRDR) of the grlA and gyrA target genes. These mutations were searched for 42 isolates of the 52 S. pseudintermedius, revealing that 27 have at least one QRDR mutation. All these mutations have been previously described except the GyrA mutation Asp83Asn, identified for the first time in this work for S. pseudintermedius. Thus, it was found that FQ resistance in this bacterium occurs mainly through mutations in target genes. It was also verified the presence of basal efflux activity, revealing the potential for emergence of resistance by exposure to these antibiotics through the activation of efflux systems. The results obtained in this Dissertation support the need for a One Health approach, which recognizes the relevance of a global perspective of the human, animal and environmental health for an adequate and effective response to the main health challenges, such as antimicrobial resistance