Doenças reumáticas mais prevalentes em mulheres: metodologias de espectrometria de massa para a identificação de novos biomarcadores de diagnóstico / prognóstico

Abstract

O Lúpus Eritematoso Sistémico (LES) e Artrite Reumatoide (AR), são doenças reumáticas inflamatórias com uma maior prevalência em mulheres. Sendo consideradas uma das 10 principais causas de morte em mulheres com menos de 75 anos, têm um elevado impacto no sistema de saúde. Embora o diagnóstico precoce destas doenças seja considerado fundamental para o seu controlo através de terapêuticas adequadas, este constitui ainda um grande desafio. Este trabalho teve como objetivo principal a utilização de métodos de espectrometria de massa de alta resolução acoplada à cromatografia líquida (LC-HRMS) para a identificação de potenciais novos biomarcadores para o diagnóstico/prognóstico de LES. Para tal, foram analisaram-se amostras de sangue recolhidas de quatro grupos de estudo: 1) doentes de LES (n=19); 2) doentes de AR (n=22); 3) doentes de espondilite anquilosante (n=23); e 4) de um grupo de controlos saudáveis (n=26). Para a identificação dos potenciais biomarcadores foram utilizadas duas metodologias: uma não direcionada e uma direcionada. Na estratégia não direcionada, inspirada nos processos de tratamento de resultados utilizados em estudos de metabolómica, os resultados foram pré-processados com o software MZmine e foram depois utilizados métodos de Análise Multivariada, com o objetivo de se observar diferenças nos vários grupos em estudo. A metodologia direcionada, visou a identificação específica de biomarcadores alvo. Para isso, num primeiro passo, foram preparados padrões destes biomarcadores, que foram caracterizados por espectrometria de massa de alta resolução de tandem (HRMS/MS). Posteriormente, construiu-se uma base dados, que foi utilizada para a procura destes biomarcadores nas amostras clínicas, utilizando o software TASQ (Bruker). Muito embora não tenha sido possível identificar qualquer biomarcador com valor diagnóstico, por qualquer das estratégias desenvolvidas, neste trabalho foram preparados e caracterizados vários padrões, que poderão ser importantes biomarcadores de doença. Adicionalmente, foi possível a otimização de metodologias de tratamento de resultados que poderão ser importantes para trabalhos posteriores. Efetivamente, a dificuldade na identificação destes biomarcadores não deverá estar ligada à desadequação dos procedimentos pós-análise utilizados, mas sim da necessidade de enriquecimento dos biomarcadores em estudo, antes da análise por LC-HRMS.

Systemic Lupus Erythematosus (SLE) and Rheumatoid Arthritis (RA) are inflammatory rheumatic diseases with a higher prevalence in women. Being considered one of the 10 main causes of death in women under 75 years of age, they have a high impact on health system. Whereas the early diagnosis of these diseases is considered key for their control through appropriate therapies, this constitutes a major challenge. This work was aimed at exploring mass spectrometry methodologies for the identification of potential new biomarkers for the diagnosis/prognosis of SLE. Towards this end, liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS) was used for the analysis of samples collected from four study groups: 1) SLE patients (n = 19); 2) RA patients (n = 22); 3) patients with ankylosing spondylitis (n = 23); and 4) from a group of healthy controls (n = 26). For the identification of potential biomarkers, two distinct methodologies were used: an untargeted and a targeted methodology. The untargeted strategy was inspired by data processing protocols used in metabolomics studies and consisted on: data pre-processed with the MZmine software followed by Multivariate Analysis for the identification of differences between groups under study. The targeted methodology was aimed at the specific identification of selected biomarkers. For this, standards were first prepared and characterized by tandem high resolution mass spectrometry (HMRS/MS) and, subsequently, a database was built, which was used to search for these potential biomarkers in clinical samples, using the TASQ software (Bruker). Although it was not possible to identify a biomarker with potential diagnostic value by any of the developed strategies, in this work standards were prepared and characterized, that might be important biomarkers of multiple diseases. Additionally, it was possible to optimize data analysis methodologies that are expected to be helpful for the subsequent work. Indeed, the difficulty in identifying the biomarkers in study is not expected to be linked to the inadequacy of the post-analysis procedures used, but rather to the need of enrichment procedures before LC-HRMS analysis.