Role of cholesteryl-hemiesters in the etiology of atherogenesis

Abstract

RESUMO: Aterosclerose é uma doença inflamatória crónica considerada a principal causa das patologias associadas às doenças cardiovasculares, sendo estas a principal causa de morte no mundo. Caracteriza-se pela retenção e modificação de LDL (liproproteínas de baixa densidade) na intima arterial que ativa uma cascata de eventos que culminam com a formação da placa aterosclerótica. Células do músculo liso vascular (VSMCs), maior componente da parede arterial, têm um papel fundamental na formação da placa. Quando estimuladas pela LDL modificada ou indiretamente pela ativação das células endoteliais e macrófagos, as VSMCs aumentam a sua capacidade proliferativa e migratória formando uma capa fibrosa protetora sobre a placa prevenindo a sua rutura. De facto, nos estadios iniciais da doença, a proliferação e migração das VSMCs são importantes para manter a estabilidade da placa. Contudo, em estadios tardios, as VSMCs começam a perder estas capacidades, tornando-se células “espumosas” (enriquecidas de lípidos) e senescentes que por sua vez pode levar à instabilidade da placa e rutura da mesma. A etiologia molecular por detrás destes eventos mantem-se desconhecida. Por conseguinte, a identificação de como as VSMCs começam a ter estes fenótipos é de crucial e uma área de grande interesse por parte da comunidade científica. Publicações do nosso grupo mostraram que um produto final da oxidação de ésteres de colesterol (que são o principal constituinte do LDL) denominados hemiesters de colesterol (ChE), estão presentes no plasma e que os níveis dos mesmos estão elevados em doentes com doenças cardiovasculares. Além disso, mostrámos ainda que estes compostos são pro-aterogénicos para macrófagos e larvas de peixe zebra. Tendo tudo isto em conta, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o efeito de ChE em VSMCs para melhor perceber o papel destes lípidos na etiologia da aterosclerose. Mais especificamente, o trabalho focou-se no papel dos ChE na disfunção lisossomal, proliferação e migração das VSMCs, já que estas propriedades desempenham um papel importante no desenvolvimento das placas ateroscleróticas. Neste trabalho mostrámos que o hemiester de colesterol mais prevalente no lipidoma do plasma de doentes cardiovasculares – hemiazelato de colesterol (ChA) – sozinho é capaz de induzir alterações in vitro a nível da função lisossomal e rigidez da membrana plasmática. VSMCs tratadas com ChA exibem uma população lisossomal dilatada na região perinuclear com pH alterado, inibição da sua capacidade degradativa e acumulação de lípidos, fenótipo semelhante ao encontrado em “células espumosas”. Contudo, em contraste com o descrito na literatura quando ocorrem defeitos lisossomais, nós não observámos ativação dos fatores de transcrição lisossomais da família MiT-TFE. De facto, nós observámos diminuição dos níveis totais de TFEB e de outros transcritos lisossomais e autofágicos. Adicionalmente, VSMCs tratadas com ChA mostram ainda uma diminuição na capacidade de migrar e proliferar que pode estar associada à disfunção lisossomal assim como com o aumento da rigidez da membrana plasmática. Em suma, este trabalho mostra que o ChA, encontrado aumentado em doentes com doenças cardiovasculares, é suficiente para alterar função lisossomal, propriedades da membrana e consequentemente proliferação e migração, o que pode ter um impacto importante no desenvolvimento da aterosclerose e outras doenças de envelhecimento.

ABSTRACT: Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease and is considered the leading cause of cardiovascular pathologies that are the main cause of death worldwide. It starts with the entrapment and modification of low density lipoprotein (LDL) in the arterial intima that activates a cascade of events that will culminate with the atherosclerotic plaque formation. Vascular smooth muscle cells (VSMCs), the most numerous component of the arterial wall, have a critical role in plaque formation. Upon stimulation by the modified LDL and/or indirectly by the endothelial cells and macrophages, VSMCs become proliferative and migrate to form a protective fibrous cap which prevents plaque rupture. Indeed, in initial stages of atherogenesis, proliferation and migration of VSMCs are important for the maintenance of plaque stability. However, in later stages, VSMCs lose these abilities becoming lipid laden “foam cells” (cells enriched with lipids) and senescent which leads to plaque instability and increase risk of rupture. The molecular aetiology involved in these events remains to be elucidated. Therefore, identifying how and why VSMCs start to have these phenotypes is of paramount importance and a major area of interest in the atherosclerosis field. Our group has already shown that an end product of cholesteryl esters oxidation (one of the main constituents of LDL), cholesteryl hemiesters (ChE), are present in human blood and their levels are higher in cardiovascular disease patients. Moreover, they are proatherogenic towards macrophages and zebrafish larvae. Taking this into account, the main objective of this work is to characterize the effect of ChE towards VSMCs to better understand the role of these lipids in the aetiology of atherosclerosis. More specifically, our work is focused on the role of ChE towards lysosomal dysfunction, migration and proliferation of VSMCs and the implication of this lysosome dysfunction on these processes. Here we show that the most prevalent cholesteryl hemiester in the plasma lipidome of cardiovascular disease (CVD) patients – cholesteryl hemiazelate (ChA) – is able to induce alterations in vitro at the level of lysosome function, plasma membrane rigidity and cell stiffness. ChA-treated VSMCs acquire a foam cell-like phenotype, characterized by lysosomes full of ChA and neutral lipids. They exhibit an enlarged perinuclear lysosomal population with altered luminal pH and inhibition of degradative capacity and cargo exit. However, in contrast with what has been generally described to occur when lysosomes become defective, we did not observe an activation of the MiT-TFE family of lysosomal transcription factors. On the contrary, we even observed a decrease in total TFEB levels and in the transcription of lysosome- and autophagy-related genes. Moreover ChA-treated VSMCs show decreased proliferation and migration capacity that can be associated with lysosomal dysfunction, increase plasma membrane rigidity and cell stiffness. Altogether, this work demonstrates that ChA, found elevated in CVD patients, is sufficient to induce lysosome dysfunction and plasma membrane rigidity affecting also cell proliferation and migration, which consequently may have a significant impact in atherosclerosis progression.