Fosforilação do efetor Tir e a sua interação com proteínas alvo do hospedeiro

Abstract

Tir é uma proteína efetora intrinsecamente desordenada (IDP) de Escherichia coli Enteropatogénica (EPEC) e Enterohemorrágica (EHEC) que é translocada para o interior do hospedeiro. Na região C-terminal (C-Tir), este efetor mimetiza quatro motivos, conhecidos como ITIMs, que contêm tirosinas (Y454, Y474, Y483, Y511) que são fosforiladas por cinases do hospedeiro. Os padrões de fosforilação resultantes são reconhecidos por uma série de proteínas do hospedeiro que desencadeiam mudanças na sinalização e nos processos celulares do mesmo. Destas proteínas, destaca-se a fosfatase SHP-1, essencial em vias de sinalização de resposta imunitária. Nesta dissertação propusemos clarificar os aspetos moleculares da interação entre C-Tir e o domínio C-SH2 de SHP-1 e perceber como molecularmente a fosforilação molda essa interação. Através da espetroscopia de RMN, foi realizada a reatribuição das ressonâncias da versão fosforilada de C-Tir e foram analisadas as propensões de estruturas secundárias. Este estudo permitiu a identificação de regiões com tendência para hélices-α, localizadas em zonas conhecidas por interagir com proteínas do hospedeiro. A fosforilação é descrita como um requisito para a interação entre C-Tir e SHP-1. Contudo, os ensaios de interação realizados entre as duas proteínas pré-fosforilação sugerem que a mesma pode ocorrer intrinsecamente, através da região ITIM, que compreende Y511, identificada como uma região com preponderância para estrutura hélice-α. Foi monitorizada a cinética e a extensão da fosforilação das quatro tirosinas, demonstrando que todas são fosforiladas simultaneamente, com Y454 a ser a mais rápida e Y483 a ser a mais lenta. Além disso, foi verificado que C-Tir fosforilada interage com o domínio C-SH2, através das quatro regiões ITIM. A região ITIM que contém Y454, cuja fosforilação é mais rápida, é a que apresenta menos afinidade para C-SH2, comparativamente com as restantes que apresentam afinidades semelhantes entre elas. Este trabalho abre caminho para novos estudos sobre os mecanismos de virulência com implicações na saúde e na doença.

Tir is an intrinsically disordered protein (IDP) from Enteropathogenic (EPEC) and Enterohemorrhagic (EHEC) Escherichia coli that is translocated into the host. In its C-terminal region (C-Tir), this effector mimics four motifs, commonly known as ITIMs, containing tyrosine residues (Y454, Y474, Y483, Y511) that are phosphorylated by host kinases. The resulting phosphorylation patterns are recognized by various host proteins that trigger changes in signaling and host cellular processes. Among these proteins is SHP-1 phosphatase, an essential protein in signaling pathways of the immune response. In this thesis, we proposed clarifying the molecular aspects of the interaction between C-Tir and the C-SH2 domain of SHP-1 and understanding how phosphorylation shapes this interaction. Using NMR spectroscopy, we reassigned the backbone NMR resonances of the phosphorylated version of C-Tir and analyzed its secondary structural propensities. This study allowed us to identify regions with a tendency for helical structures located at sites known to interact with host proteins. Phosphorylation seems to be essential for the interaction between Tir and SHP-1. However, binding assays between the two proteins pre-phosphorylation suggests that it can occur intrinsically through the ITIM region comprising Y511, identified to adopt a partial-folded α-helix We also monitored the kinetics and the extension of the phosphorylation reaction of the four tyrosines in the ITIM regions. In doing so, we found that the four positions are phosphorylated simultaneously, with Y454 being the fastest and Y483 being the slowest. Moreover, we showed that phosphorylated C-Tir interacts with the C-SH2 via its four ITIMs. The ITIM region containing Y454, whose phosphorylation is faster, is the one with a lower affinity for the C-SH2, than the others with similar binding strengths. This work paves the way for further studies to understand virulence mechanisms with implications for health and disease.