Antibacterial, antiparasitic and anticancer properties of host-defence peptides from argentinian amphibians

Abstract

Os péptidos de defesa do hospedeiro (PDH) são geralmente moléculas curtas, anfipáticas e catiónicas que fazem parte do sistema imune inato da maioria dos organismos multicelulares. Inicialmente descritos como péptidos antimicrobianos (PAMs) devido à interação e destruição de paredes celulares bacterianas que são naturalmente aniónicas, contudo, estudos recentes mostraram que os PDH possuem uma gama de ação mais variada sendo capazes de interagir com células cancerígenas e podendo assim também ser designados de péptidos anticancerígenos (PACs). O aumento da multirresistência a fármacos, juntamente com a baixa taxa de descoberta de novos compostos e o facto de os tratamentos atualmente utilizados na terapêutica de várias doenças poderem ser abrasivos e até prejudiciais aos seres humanos, culminaram na necessidade urgente de estudar novas alternativas como os PDH. Várias espécies de anfíbios Patagónicos adaptaram-se a sobreviver em condições climáticas adversas, habitando zonas áridas ou semiáridas da Patagónia. A pele destes anfíbios produz uma secreção protetora a partir da qual os PDH foram extraídos, identificados e sintetizados nos péptidos PSo-4, PSo-7, PSo2-2, Thau-3 e Ooc-1. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as propriedades antimicrobianas e anticancerígenas dos referidos péptidos e a sua estrutura em solução e na presença de vesículas lipídicas. A atividade antimicrobiana bem como a interação com membranas bacterianas foram avaliadas em bactérias Gram-positivas e -negativas por determinação da concentração mínima inibitória e através de microscopia de força atómica. Foram ainda realizados ensaios antiparasitários em formas sanguíneas, tipo selvagem, de Trypanosoma brucei brucei, ao passo que estudos anticancerígenos foram praticados em células Huh-7 de carcinoma hepatocelular humano através de métodos fluorimétricos e de absorção respetivamente. A caracterização da conformação dos péptidos, quando em meio aquoso ou em solução contendo vesículas lipídicas POPC:POPG, foi realizada por ensaios de espectrofluorometria e de dicroísmo circular. PSo-4, PSo-7, Thau-3 e Ooc-1 exibiram atividade antimicrobiana, mas apenas contra E. coli. PSo-4 demonstrou a atividade mais forte enquanto Ooc-1 provou ser bactericida. A análise por AFM apoia a hipótese de que a ação destes péptidos possa ocorrer ao nível da parede celular bacteriana, ou potencialmente interferindo com vias ou alvos intracelulares, culminando na desintegração da célula. Resultados preliminares também indicam que o péptido Ooc-1 exerce efeitos inibitórios no parasita T. b. brucei. Além disso, os péptidos Pso-7, Pso-4 e PSo2-2 revelaram potencial nocivo contra células Huh-7. Estruturalmente, a maioria dos péptidos apresentou propensão à agregação, quando em solução, e estrutura secundária com algum conteúdo de α-hélice, contrariamente a PSo-7 e PSo-4 que mantiveram uma disposição aleatória e baixos níveis de agregação. Tendo em consideração o comportamento e raio de ação demonstrados, é nossa convicção de que estes péptidos seriam dignos candidatos a investigação adicional e possível manipulação a nível da sua sequência, com o fim de aperfeiçoar as capacidades demonstradas de modo a abrir um caminho viável de desenvolvimento farmacológico.

Host-defence peptides (HDPs) are usually short, cationic and amphipathic molecules that are part of the innate immune system of most multicellular organisms. Initially described as antimicrobial peptides (AMPs) due to their interaction and destruction of bacterial cell walls which are naturally anionic, however, recent studies have shown that HDPs have a broader range of action being able to interact with cancer cells and may therefore also be referred to as anticancer peptides (ACPs). Increasing worldwide multidrug resistance (MDR) together with the low discovery rate of new drugs and the fact that the current treatments used in the therapy of various diseases can be very harsh and damaging to human beings, culminated in an urgent need to study new alternatives such as HDPs. Several species of Patagonian amphibians have adapted to survive in adverse climatic conditions, inhabiting arid or semi-arid zones of Patagonia. The skin of these amphibians produces a protective secretion from which the HDPs were extracted, identified and synthesized into peptides PSo-4, PSo-7, PSo2-2, Thau-3 and Ooc-1. The aim of this work was to characterize the antimicrobial and anticancer properties of the peptides mentioned as well as their structure in solution and in the presence of lipid vesicles. Antimicrobial activity and interaction with bacterial membranes were assessed in Gram-positive and Gram-negative bacteria by minimal inhibitory concentration determination and atomic force microscopy. In addition, antiparasitic assays were carried out on wild-type bloodstream forms of Trypanosoma brucei brucei while anticancer studies were performed on human hepatocellular carcinoma Huh-7 cells through fluorescence and absorption spectrophotometry methods respectively. The characterization of the peptides conformation when in aqueous medium or in a solution containing POPC:POPG lipid vesicles was done via spectrofluorometric and circular dichroism assays PSo-4, PSo-7, Thau-3 and Ooc-1 exhibited antimicrobial activity but only against the Gram-positive bacteria E. coli. PSo-4 showed the strongest activity while Ooc-1 proved to be bactericidal. Analysis by AFM supports the hypothesis that the action of these peptides may occur either at the bacterial cell wall level or by potentially interfering with intracellular pathways or targets, culminating in cell disintegration. Preliminary results also indicate that peptide Ooc-1 exerts inhibitory effects on the parasite T. brucei brucei. Furthermore, peptides PSo-7, PSo-4, and PSo2-2 revealed deleterious capacity against Huh-7 cells. Structurally most peptides exhibited a propensity for aggregation, when in solution, and presented a secondary structure with some α-helix content, except for PSo-7 and PSo-4 that maintained a random coil arrangement and lower aggregation levels. Considering the behaviour and scope of action demonstrated, we believe these peptides to be worthy candidates for further investigation and possible sequence manipulation to enhance their demonstrated capabilities in order to open the path of pharmacological viability.