Detection and partial phylogenetic characterization of adenovituses in reptiles from the Lisbon zoo

Abstract

Os adenovírus (AdVs) são vírus de genoma de ADN de cadeia dupla que infetam diversos hospedeiros vertebrados, incluindo humanos. A família Adenoviridae compreende cinco géneros (Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovirus, Mastadenovirus e Siadenovirus) e um sexto género (Testadenovirus) foi proposto para acomodar novas espécies de AdVs encontradas em tartarugas da superfamília Testudinoidea. Os AdVs, considerados dos vetores vacinais mais eficazes, têm sido também utilizados como vetores de transferência génica e agentes oncolíticos em protocolos terapêuticos experimentais. Neste estudo, 120 amostras fecais de 43 espécies de répteis do Jardim Zoológico de Lisboa foram testadas para a presença de ADN de AdVs, utilizando uma nested PCR para amplificação de uma região conservada do gene da polimerase de ADN, revelando uma prevalência de 28,3% (34/120). Os fragmentos amplificados foram sequenciados e a sequência utilizada para análise filogenética com 52 sequências homólogas de referência. Esta análise, baseada em alinhamentos múltiplos de nucleótidos e aminoácidos, levou à deteção de sequências geneticamente aparentadas, algumas distintas de AdVs descritos anteriormente, distribuindo-se por vários agrupamentos, demonstrando uma elevada diversidade genética. Uma sequência de AdV de jabuti-de-patas-vermelhas agrupou com sequências obtidas anteriormente de outras tartarugas da superfamília Testudinoidea, podendo, juntamente com outras duas já descritas para esta espécie, representar uma nova espécie de testadenovírus. A inferência filogenética posicionou também uma sequência obtida de uma tartaruga-de-água-doce-americana com o AdV-1 de rãs (género Siadenovirus), o que pode ser devido a contaminação ambiental. Outras sequências obtidas de tartarugas agruparam com sequências de diferentes espécies de AdVs aviários (género Aviadenovirus), juntamente com sequências de três espécies de boas. Estas últimas apresentaram uma diversidade genética muito baixa, o que está de acordo com uma origem comum. As aves que constituem alimento destas boas podem estar infetadas com AdVs aviários, os quais, dada a topologia da árvore, podem mesmo representar uma nova espécie de aviadenovírus. Sequências de três espécies de lagartos e uma serpente formaram um grupo monofilético com sequências de AdV-1 dos agamídeos (género Atadenovirus). Estes AdVs são endémicos em lagartos-dragão em todo o mundo, sendo os resultados descritos consistentes com este facto. Finalmente, foram encontradas várias sequências de mastadenovírus, formando dois agrupamentos distintos, respetivamente com AdV-2 murino (nove sequências, de oito espécies de serpentes) e um AdV de ratazana (sete sequências, de duas serpentes e dois lagartos). Cada um destes agrupamentos apresenta baixa diversidade genética, sendo isso consistente com origens virais comuns, os roedores usados como alimento. Independentemente da sua origem, é concebível que o agrupamento de AdVs de ratazana represente uma nova espécie de mastadenovírus. Não se pode afirmar que o ADN detetado nestes répteis indique necessariamente que estes sejam hospedeiros naturais de AdVs. Os resultados obtidos podem ser devidos à ingestão de alimentos infetados, ou a contaminação ambiental, mas também a prévia transmissão cruzada entre hospedeiros (de aves e roedores, em particular). Estes répteis são mantidos em instalações próximas de outros animais e a possibilidade de infeção cruzada com vírus de hospedeiros distantes é elevada. Para uma caracterização mais robusta dos AdVs detetados, seria importante a obtenção de sequências génicas completas ou, preferencialmente, do próprio genoma viral.

Adenoviruses (AdVs) are double-stranded DNA viruses that infect a wide range of vertebrate hosts, including humans. Viruses of the Adenoviridae family are classified into genera Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovirus, Mastadenovirus and Siadenovirus. A sixth genus (Testadenovirus) has been proposed for a new AdV lineage found in Testudinoidea turtles. AdVs, considered one of the most effective vaccine vectors, have also been used as gene transfer vectors (e.g. gene therapy protocols) and as experimental oncolytic agents in cancer therapy. In this study, 120 faecal samples from 43 species of reptiles from the Lisbon Zoo were screened for AdV DNA, using a consensus nested PCR targeting a conserved region of the DNA polymerase gene, revealing a prevalence of 28.3% (34/120). The PCR amplicons were sequenced and used for phylogenetic analysis, together with 52 homologous reference sequences. Phylogenetic reconstructions, based on nucleotide and amino acid multiple alignments, led to the recognition of several sequences closely related, but distinct from previously described AdVs. The sequences were distributed all over the phylogenetic trees, showing the high genetic diversity of the AdVs circulating in the Lisbon Zoo. An AdV sequence from a red-footed tortoise (the third described for this species) clustered with previously obtained sequences from other Testudinoidea. Altogether, these three sequences may represent a novel testadenovirus species. Phylogenetic inference positioned a sequence detected from a red-eared slider close to frog AdV-1, within the genus Siadenovirus, which may be due to environmental contamination. Other sequences obtained from turtles and tortoises clustered with different species of fowl AdV sequences, in Aviadenovirus genus, along with sequences from three species of boas. The latter sequences presented very low genetic diversity, which is in accordance with a common origin. The chicks and quails the snakes are fed could be infected with a fowl AdV, which, given tree topology, may represent a new aviadenovirus species. Sequences from three species of lizards and a snake formed a monophyletic group with agamid lizard AdV-1 sequences, within the Atadenovirus genus. Agamid AdVs are widespread in inland bearded dragon populations all over the world and our results are consistent with this finding. Finally, several mastadenovirus sequences were found, forming two very distinctive clusters, respectively with murine AdV-2 (nine sequences, from eight species of snakes) and a rat AdV (seven sequences, from two snakes and two lizards). Each of these clusters presented low genetic diversity and this is consistent with common viral sources, the rodents used as food. Irrespective of its origin, it is conceivable that the rat AdV cluster represent a new mastadenovirus species. It cannot be stated that the DNA detected in these reptiles indicates they are AdV natural hosts. Our findings could be due to ingestion of infected food, or environmental contamination, but also previous AdV host switches from other hosts (birds and rodents, particularly). Also, these reptiles are in zoo facilities close to other animals and the possibility of cross infection with viruses from distant hosts is high. For further characterization of the AdVs detected, complete gene or, preferably, full genome sequences are mandatory.