Caracterização dos mecanismos de resistência à colistina em isolados clínicos de Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenemos

Abstract

A colistina é um dos últimos recursos para tratar infecções causadas por estirpes de Acinetobacter baumannii multirresistentes (MDR) com resistência adicional aos carbapenemos (XDR). A resistência à colistina deve-se principalmente à presença de mutações nos genes envolvidos na biossíntese do lípido A (LpxACD) ou devido a mutações nos genes que codificam o sistema de dois componentes PmrAB. Apesar de ser um assunto controverso, a resistência à colistina tem também sido associada à actividade de efluxo. Neste trabalho, investigamos a interacção entre a actividade de efluxo e a presença de mutações associadas à resistência à colistina em A. baumannii MDR resistentes aos carbapenemos. Analisamos uma colecção de 74 estirpes de A. baumannii das quais 72 eram XDR. A susceptibilidade aos antibióticos foi testada pelo método de difusão em disco (Kirby-Bauer). A determinação das concentrações mínimas inibitórias (CMIs) da colistina, brometo de etídio (EtBr, substrato de efluxo) e tioridazina (TZ, inibidor de efluxo) foram realizadas por microdiluição. A presença de mutações nos genes associados à resistência à colistina foi investigada por PCR e sequenciação de DNA. A existência de actividade de efluxo foi estudada pela determinação das CMIs usando o método “checkerboard” na presença de TZ. A tipagem molecular das estirpes resistentes à colistina foi feita por ERIC-PCR e MLST. Das 72 estirpes de A. baumannii resistentes aos carbapenemos, oito apresentaram resistência à colistina variando entre 64 e 512 μg/ml. As CMIs do EtBr e TZ permaneceram constantes entre as estirpes resistentes à colistina. A pesquisa de mutações nos genes associados à resistência à colistina demostrou a presença de mutações nos genes lpxA, lpxC, lpxD, pmrA ou pmrB. Os ensaios de sinergia por “checkerboard” mostraram redução das CMIs da colistina na presença de TZ, variando entre 8x e 256x. A tipagem molecular por ERIC-PCR mostrou que as estirpes resistentes à colistina podem ser distribuídas em três clusters. Sete estirpes pertencem ao ST350 e uma pertence ao ST218. Das sete estirpes pertencentes ao ST350, duas foram isoladas em 2008 e cinco em 2010, indicando disseminação clonal de A. baumannii resistentes à colistina. Esta é a primeira descrição da presença do clone ST350 em Portugal. Este estudo demostra que a actividade de efluxo desempenha um papel na resistência à colistina, apesar também da presença de mutações nos genes associados à resistência à colistina. A actividade do efluxo pode afectar o desfecho clínico de infecções causadas por A. baumannii e o uso de inibidores do efluxo deve ser considerado para o desenvolvimento de novas terapias adjuvantes para combater a resistência à colistina.

Colistin is one of the last resources to treat infections caused by multidrug resistant (MDR) Acinetobacter baumannii strains with additional resistance to carbapenems (XDR). Colistin resistance is mainly due to the presence of mutations in genes involved in lipid A biosynthesis (LpxACD) or due to mutations in genes that encode the two-component system PmrAB. Although a controversial topic, colistin resistance has also been associated with efflux activity. In this work, we investigated the interplay between efflux activity and the presence of mutations associated with colistin resistance in carbapenem resistant MDR A. baumannii. We analysed a collection of 74 MDR A. baumannii strains, of which 72 were XDR. Drug susceptibility was accessed by disc diffusion (Kirby-Bauer). Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of colistin, ethidium bromide (EtBr, efflux substrate) and thioridazine (TZ, efflux inhibitor) was performed by broth microdilution. The presence of mutations in the genes associated with colistin resistance were investigated by PCR and DNA sequencing. The existence of efflux activity was studied by MIC determination through checkerboard assays in the presence of TZ. Molecular typing of the colistin resistant strains was done by ERIC-PCR and MLST. Among the 72 carbapenem-resistant A. baumannii strains, eight presented resistance to colistin ranging from 64 to 512 μg/ml. MICs of EtBr and TZ remain constant among the colistin resistant strains. The search of mutations in the genes associated with colistin resistance showed mutations in lpxA, lpxC, lpxD, pmrA or pmrB. Synergistic checkerboard assays showed reductions of the MICs ranging from 8- to 256-fold for colistin in presence of TZ. Strain typing by ERIC-PCR showed that the colistin resistant strains could be distributed three clusters. Seven strains belong to the ST350 and the remaining one belong to the ST218. Among the seven ST350 strains, two were isolated in 2008 and five in 2010, indicating clonal dissemination of colistin resistant strains. This is the first description of the ST350 clone in Portugal. This study demonstrated that efflux activity plays a role in colistin resistance despite the presence of mutations in the genes associated with colistin resistance. Efflux activity may affect the clinical outcome of infections caused by A. baumannii and the use of efflux inhibitors should be considered for the development of new adjuvant therapies to tackle colistin resistance.