A parede celular de Staphylococcus aureus como alvo da endolisina Twort – Estrutura, atividade e ligação ao peptidoglicano por Ressonância Magnética Nuclear

Abstract

As estirpes de Staphylococcus aureus (S. aureus) que adquiriram resistência a antibióticos nomeadamente, as estirpes resistentes à meticilina (MRSA), são dos agentes patogénicos com mais impacto na saúde pública a nível mundial. Existem várias estratégias para reduzir o impacto das infeções por estas bactérias incluindo, o controlo restrito do uso de antibióticos, medidas profiláticas para impedir a contaminação e/ou disseminação e a busca e desenvolvimento de novos fármacos antimicrobianos para tratar infeções quer humanas quer animais causadas por estas bactérias. As proteínas fagolíticas ou endolisinas possuem atividade bactericida e podem ser usadas como alternativa aos antibióticos convencionais no tratamento de infeções provocadas por bactérias MRSA. Esta classe de proteínas possui uma probabilidade baixa, quase nula, de desenvolver resistência, e está classificada numa nova classe de antibióticos potentes denominado por enzibióticos. A endolisina do fago Twort possui atividade bactericida contra uma larga gama de estirpes de S. aureus, incluindo estirpes resistentes e sensíveis a antibióticos. Esta proteína é composta por três domínios estruturais e funcionais, com dois domínios que possuem atividade de hidrolase do peptidoglicano (endopeptidase e amidase) e um domínio carboxi-terminal de ligação ao peptidoglicano (denominado de CBD). A atividade e a especificidade da endolisina para S. aureus é dada pela combinação da atividade destes domínios e é regulada pela interação entre os domínios independentes. Neste contexto, o objetivo principal deste trabalho é caracterizar a interação do domínio CBD da endolisina do fago Twort com o peptidoglicano de S. aureus e identificar os determinantes moleculares para o reconhecimento do peptidoglicano. Para tal, utilizou-se diferentes técnicas bioquímicas focadas no RMN. A estrutura 3D do domínio CBD foi determinada por RMN usando a seguinte metodologia: atribuição das ressonâncias usando espectros 3D de ressonância tripla; a atribuição automática do 3D NOESY usando o noeassign/CYANA; refinamento manual usando o programa CARA e cálculo da estrutura tridimensional usando o CYANA. As 20 melhores estruturas apresentaram os parâmetros: 1431 restrições de distância, “target function” de 2.52 A2 e RMSD cadeia principal de 0.57 Å. A estrutura resultante foi analisada e apresenta um enrolamento do tipo SH3b. A análise dos ensaios de titulação entre o domínio CBD e a mistura de fragmentos de peptidoglicano monitorizados por 1H-15N-HSQC demonstrou que existem dois locais de ligação ao peptidoglicano em faces opostas no domínio. Estes resultados foram comparados com estudos anteriormente realizados com o domínio SH3b da lisostafina. Cada região liga a zonas diferentes do peptidoglicano (a região 1 liga no péptido de transpeptidação constituído por 5 glicinas, e a região 2 liga ao tetrapéptido que está ligado pelo resíduo L-Lys na posição 3 com a região carboxi- terminal do péptido de transpeptidação). Foi possível identificar uma região na zona do distal loop do domínio CBD que se propõe que liga ao tetrapéptido que está ligado na região amino- terminal do péptido de transpeptidação (ligado à D-Ala na posição 4 do tetrapéptido).