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Publicação
Engineering a Galactose Oxidase for Enlarged Biotechnological Applications
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Resumo(s)
Lignocellulosic biomass (LCB) is a promising source of feedstocks that can substitute fossil petroleum-based fuels and chemicals, since it is renewable, abundant and their utilisation does not compete with food crops. From the fractionation of LCB, lignin, cellulose and hemicellulose monomers can be bio-transformed into final products that are of biotechnological interest. Galactose oxidase (GalOx), harbouring a copper radical cofactor, regioselectively catalyse the oxidation of D-galactose, but also of primary alcohols (like benzyl alcohol) and furans (like hydroxymethylfurfural, HMF) prevenient from LCB, using O2 as the co-substrate. In this work, we aimed to improve the activity of PsGalOx, a bacterial enzyme recently identified in the lab, towards the oxidation of interesting chemical precursors such as benzyl alcohol. Directed evolution steps were optimised and after thousands of variants screened, two variants (14G3 and 41C7) were found in the two sequential rounds performed. Variant 14G3 carries only mutation N511S and variant 41C7 carries additionally the mutation D446G. The purified enzyme preparations demonstrated that 14G3 exhibited a significant 10- to 20-fold increase in catalytic efficiency (kcat/Km) across the three substrates (benzyl alcohol, D-galactose and HMF), when compared to its parent. This enhancement is likely due to alterations in the active site architecture, as the N511S mutation is positioned in close proximity to this region. Nevertheless, the mutation introduced in 41C7 did not affect the catalytic performance, yet a 2-fold increase in protein production was observed. Both variants showed a slight loss in thermostability, suggesting a trade-off between activity and stability. Preliminary tests on immobilized enzymes in metal affinity resins showed that purified enzymes could be successfully attached to the carrier, however, a drop of activity was observed upon immobilisation. The nickel resin showed better results than cobalt resin, maintaining its activity even after 30 days of storage at 4 ºC. Further optimisation and development of enzyme immobilisation need to be performed to increase the efficiency of the enzyme when immobilised and, eventually, the stability to make it applicable for larger-scale applications in biotechnological industries and biorefineries.
A biomassa lignocelulítica (BLC) é uma fonte renovável, abundante e promissora de matérias-primas que pode substituir os combustíveis e químicos derivados do petróleo. Adicionalmente a sua utilização não compete com os cultivos alimentares. A partir do fracionamento da BLC, monómeros de lignina, celulose e hemicelulose podem ser bio-transformados em produtos finais de interesse biotecnológico. As galactose oxidases (GalOx), tendo um cofator de cobre acoplado a um radical Tyr-Cys, catalisa regioseletivamente a oxidação da D-galactose, mas também de álcoois primários (como o álcool benzílico) e furanos (como o hidroximetilfurfural, HMF) proveniente da BLC, usando apenas O2 como co-substrato. Neste trabalho, tivemos como objetivo melhorar a atividade da PsGalOx, uma enzima bacteriana recentemente identificada no laboratório capaz de oxidar compostos químicos interessantes como o álcool benzílico. Os passos de evolução dirigida foram otimizados e, após milhares de variantes rastreados, dois variantes (14G3 e 41C7) foram encontrados em rondas sequencialmente realizadas. O variante 14G3 carrega apenas uma mutação N511S e o variante 41C7 contém adicionalmente a mutação D446G. A análise das preparações enzimáticas demonstraram que o variante 14G3 apresenta um aumento significativo de 10 a 20 vezes na eficiência catalítica (kcat/Km) nos três substratos (álcool benzílico, D-galactose e HMF), comparativamente ao parente da geração anterior. Este aumento é provavelmente devido a alterações na arquitetura do centro ativo, uma vez que a mutação N511S está localizada na sua proximidade. No entanto, a mutação introduzida no 41C7 não teve nenhum efeito no desempenho catalítico, contudo foi observado um aumento de duas vezes na produção de proteína. Ambas as variantes mostraram uma pequena perda na termoestabilidade, sugerindo uma compensação entre atividade e estabilidade. Testes preliminares usando enzima imobilizada em resinas metálicas de afinidade mostraram que a enzima purificada pode ser ligada com sucesso ao suporte, no entanto, uma perda de atividade foi observada após imobilização. A resina de níquel apresentou melhores resultados que a resina de cobalto, mantendo a sua atividade mesmo após 30 dias de armazenamento a 4 ºC. Será necessário otimizar e desenvolver o processo de imobilização enzimática para aumentar a eficiência da enzima aquando ligada à resina e, eventualmente, a estabilidade, para a tornar aplicável a aplicações em maior escala em indústrias biotecnológicas e biorrefinarias.
A biomassa lignocelulítica (BLC) é uma fonte renovável, abundante e promissora de matérias-primas que pode substituir os combustíveis e químicos derivados do petróleo. Adicionalmente a sua utilização não compete com os cultivos alimentares. A partir do fracionamento da BLC, monómeros de lignina, celulose e hemicelulose podem ser bio-transformados em produtos finais de interesse biotecnológico. As galactose oxidases (GalOx), tendo um cofator de cobre acoplado a um radical Tyr-Cys, catalisa regioseletivamente a oxidação da D-galactose, mas também de álcoois primários (como o álcool benzílico) e furanos (como o hidroximetilfurfural, HMF) proveniente da BLC, usando apenas O2 como co-substrato. Neste trabalho, tivemos como objetivo melhorar a atividade da PsGalOx, uma enzima bacteriana recentemente identificada no laboratório capaz de oxidar compostos químicos interessantes como o álcool benzílico. Os passos de evolução dirigida foram otimizados e, após milhares de variantes rastreados, dois variantes (14G3 e 41C7) foram encontrados em rondas sequencialmente realizadas. O variante 14G3 carrega apenas uma mutação N511S e o variante 41C7 contém adicionalmente a mutação D446G. A análise das preparações enzimáticas demonstraram que o variante 14G3 apresenta um aumento significativo de 10 a 20 vezes na eficiência catalítica (kcat/Km) nos três substratos (álcool benzílico, D-galactose e HMF), comparativamente ao parente da geração anterior. Este aumento é provavelmente devido a alterações na arquitetura do centro ativo, uma vez que a mutação N511S está localizada na sua proximidade. No entanto, a mutação introduzida no 41C7 não teve nenhum efeito no desempenho catalítico, contudo foi observado um aumento de duas vezes na produção de proteína. Ambas as variantes mostraram uma pequena perda na termoestabilidade, sugerindo uma compensação entre atividade e estabilidade. Testes preliminares usando enzima imobilizada em resinas metálicas de afinidade mostraram que a enzima purificada pode ser ligada com sucesso ao suporte, no entanto, uma perda de atividade foi observada após imobilização. A resina de níquel apresentou melhores resultados que a resina de cobalto, mantendo a sua atividade mesmo após 30 dias de armazenamento a 4 ºC. Será necessário otimizar e desenvolver o processo de imobilização enzimática para aumentar a eficiência da enzima aquando ligada à resina e, eventualmente, a estabilidade, para a tornar aplicável a aplicações em maior escala em indústrias biotecnológicas e biorrefinarias.
Descrição
Palavras-chave
lignocellulosic biomass carbohydrate-active enzymes galactose oxidase directed evolution catalytic efficiency sustainable chemistry