Publicação
Production and Characterization of Odorant Binding Proteins
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Roque, Cecília | |
| dc.contributor.advisor | Barbosa, Arménio | |
| dc.contributor.author | Calvário, Joana Ramos dos Santos | |
| dc.date.accessioned | 2022-03-02T14:48:57Z | |
| dc.date.available | 2024-11-01T01:32:14Z | |
| dc.date.issued | 2022-02-09 | |
| dc.description.abstract | Odorant Binding Proteins (OBPs) are small soluble proteins responsible for the binding, solubilization and transportation of Volatile Organic Compounds (VOCs) to olfactory receptors in vertebrates and insects. These proteins have been gaining attraction in artificial olfaction fields due to their natural selectivity toward VOCs. Furthermore, OBPs are reported to be structurally stable, resistant to thermal and proteolytic degradation, and easily produced in E. coli. Therefore, it is possible to implement OBPs in biosensors in order to develop a sensor array with improved selectivity by mimicking the biological olfactory system. The main objective of this work is the expression, purification and characterization of insect OBPs, for further application in an electronic nose biosensor. The design of a vector construct with OBP genes under an IPTG inducible promoter allowed the proteins’ recombinant expression in E. coli. A first expression test revealed the presence of OBPs as inclusions bodies (IBs). Further expression strategies were tested to improve protein solubility during expression, however proved to be ineffective. Thus, CPI (Contact Pathway Inhibitor) from Phlebotomus duboscqi and OBP56a from Phormia regina were selected, expressed as IBs, solubilized and purified. Different purification protocols were assessed. Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) in denaturing conditions demonstrated to be the most successful approach, with purities of 86% (CPI) and 92% (OBP56a), and recoveries of 71% (CPI) and 50% (OBP56a). Western blot confirmed the presence of monomeric and dimeric forms of the purified OBPs. The secondary structure of the alpha helix rich insect OBPs was assessed by Circular Dichroism. We consider that further optimizations are still required, mainly in dialysis and a second purification step. Lastly, preliminary results were obtained in gas sensing experiments, in which OBP56a functionalized sensor has shown to be selective toward acetic acid. Overall, this work explored different techniques regarding expression and purification of insect OBPs in inclusion body form. With further optimization, these proteins can be employed in VOC detecting biomaterials, for applications such as the early detection of viral and bacterial infections, cancers and inflammatory diseases. | pt_PT |
| dc.description.abstract | As proteínas de ligação a compostos odorantes (OBPs) são proteínas solúveis de tamanho pequeno responsáveis pela ligação, solubilização e transporte de Compostos Orgânicos Voláteis (VOCs) para recetores olfativos em vertebrados e insetos. Estas proteínas têm vindo a ganhar atenção em sistemas olfativos artificiais devido à sua seletividade natural para com os VOCs. Além disso, as OBPs são estruturalmente estáveis, resistentes à degradação térmica e proteolítica, e facilmente produzidas em E. coli. Portanto, é possível implementar OBPs em biosensores de modo a desenvolver um conjunto de sensores com uma seletividade melhorada, havendo assim um paralelismo com o sistema olfativo biológico. O principal objetivo deste trabalho é a expressão, purificação e caracterização de OBPs de insetos, para posterior aplicação num biossensor de nariz eletrónico. As proteínas selecionadas foram expressas em E. coli após a clonagem de um vetor com genes que codificam as mesmas OBPs sob um promotor indutível por IPTG. Um primeiro teste de expressão revelou a presença de OBPs como corpos de inclusão(IBs). Estratégias de expressão adicionais foram testadas para melhorar a solubilidade das proteínas durante a expressão, no entanto mostraram-se ineficazes. Assim, a CPI (Contact Pathway Inhibitor) de Phlebotomus duboscqi e OBP56a de Phormia regina foram selecionadas, expressas em IBs, solubilizadas e purificadas. Foram avaliados diferentes protocolos de purificação. A cromatografia de afinidade por iões metálicos imobilizados (IMAC) em condições desnaturantes demonstrou ser a abordagem mais bem sucedida, com purezas de 86% (CPI) e 92% (OBP56a) e recuperações de 71% (CPI) e 50% (OBP56a). Resultados de western blot confirmaram a presença de formas monoméricas e diméricas das OBPs purificadas. A estrutura secundária das OBPs de insetos, composta por hélices alfa, foi avaliada por Dicroísmo Circular. Consideramos que ainda são necessárias otimizações adicionais, principalmente no protocolo de diálise e na aplicação de um segundo passo de purificação. Por último, resultados preliminares foram obtidos em experiências de deteção de VOCs, nas quais o sensor funcionalizado com OBP56a mostrou ser seletivo para o ácido acético. No geral, este trabalho explorou diferentes técnicas de expressão e purificação de OBPs de insetos na forma de corpos de inclusão. Com otimização adicional, estas proteínas podem ser utilizadas em biossensores para a deteção de VOCs, para aplicações como a deteção precoce de infeções virais e bacterianas, cancros e doenças inflamatórias. | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10362/133791 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.relation | CENT-ERC-2014-STG-639123 | pt_PT |
| dc.relation | Applied Molecular Biosciences Unit | |
| dc.relation | Applied Molecular Biosciences Unit | |
| dc.subject | Odorant Binding Proteins | pt_PT |
| dc.subject | insect OBPs | pt_PT |
| dc.subject | expression | pt_PT |
| dc.subject | purification | pt_PT |
| dc.subject | gas sensing | pt_PT |
| dc.subject | VOCs | pt_PT |
| dc.title | Production and Characterization of Odorant Binding Proteins | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardNumber | UIDP/04378/2020 | |
| oaire.awardNumber | UIDB/04378/2020 | |
| oaire.awardTitle | Applied Molecular Biosciences Unit | |
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| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT/6817 - DCRRNI ID/UIDP%2F04378%2F2020/PT | |
| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT/6817 - DCRRNI ID/UIDB%2F04378%2F2020/PT | |
| oaire.fundingStream | 6817 - DCRRNI ID | |
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| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
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| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
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| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| relation.isProjectOfPublication | 38373452-5c9c-4724-8def-f03314ecce0e | |
| relation.isProjectOfPublication | e07cf232-4705-4b5b-b2c4-af8f25311076 | |
| relation.isProjectOfPublication.latestForDiscovery | 38373452-5c9c-4724-8def-f03314ecce0e | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Biotecnologia | pt_PT |
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