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Publicação
Characterization of bacterial multitask ATPases from Type I ABC transporters
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Orientador(es)
Resumo(s)
Bacterial ABC-Type I importers belong to one of the largest and most diverse transporter
superfamilies, which make use of ATP binding and hydrolysis to drive transport of several substrates
across membranes. These transporters share the same modular architecture of two transmembrane
domains (TMDs) and two ATPases or nucleotide-binding domains (NBDs). Additionally, importers rely
on an auxiliary domain for binding the substrate and delivery to the TMDs, the substrate-binding
protein (SBP).
Bacillus subtilis MsmX has been established as a multitask ATPase (NBD), capable of
energizing several ABC sugar importers. Most recently, our laboratory has identified several ATPases
from bacterial species, the vast majority belonging to the Firmicutes phylum, capable of
complementing MsmX function in the AraNPQ and GanSPQ transport systems of B. subtilis.
Here, to assess how widespread multitask ATPases are, NBDs from bacteria belonging to other phyla
were characterized to determine their multitask capabilities and their interspecies exchangeability in
B. subtilis.
The results show that Mycobacterium tuberculosis SugC and Thermus thermophilus MalK1 are
not capable of energizing either the AraNPQ and MelEDC transport systems, in the absence of MsmX.
However, it was found that both proteins do not accumulate in the cells most probably due to
differences in the codon usage between B. subtilis and both M. tuberculosis and T. thermophilus.
Additionally, we demonstrate that out of the previously identified ATPases, ABC_Bt (Bacillus
thuringiensis), MsmK (Streptococcus pneumoniae) and ABC_Cd (Clostridioides difficile) are capable of
energizing the MelEDC transporter, whilst YurJ (B. subtilis), ABC_Sa (Staphylococcus aureus) and
ABC_Syn (Synechocystis sp.) are not.
To map the functional domains of multitask NBDs, a MsmX-MsmK chimeric protein was
constructed and characterized. The results revealed that the chimeric protein is unable to energize
both the AraNPQ and MelEDC transport systems, but it accumulates in the cell suggesting that the
fused domains do not adopt a proper conformation resulting in an inactive protein.
Using a bacterial two-hybrid system (BACTH) in Escherichia coli, we additionally show that
YurJ is not able to form homodimers nor heterodimers with MsmX in the absence of TMDs.
Moreover, the results indicate that MsmX displays a strong interaction with the TMDs AraP, MelD
and GanP, while YurJ only interacts with AraP.
Importadores ABC Tipo I bacterianos pertencem a uma das maiores e mais diversas superfamílias de transportadores, fazendo uso da ligação e hidrólise de ATP para energizar o transporte de vários substratos através de membranas. Estes transportadores partilham a mesma arquitetura modular de dois domínios transmembranares (TMDs) e duas ATPases ou domínio de ligação a nucleótidos (NBDs). Adicionalmente, os importadores dependem de um domínio auxiliar para a ligação do substrato e entrega do mesmo aos TMDs, a proteína de ligação ao substrato (SBP). MsmX de Bacillus subtilis foi estabelecida como uma ATPase (NBD) multitarefa, capaz de energizar vários importadores ABC de açúcares. Mais recentemente, o nosso laboratório identificou várias ATPases de bactérias, a maioria destas pertencentes ao filo Firmicutes capazes de complementar a função de MsmX nos sistemas de transporte AraNPQ e GanSPQ. Para averiguar o quão abrangente é a existência de ATPases multitarefa, NBDs de bactérias pertencentes a outros filos foram caracterizadas com a intenção de determinar a sua capacidade multitarefa e a permutabilidade interespécie em B. subtilis. Os resultados demonstram que SugC de Mycobacterium tubercolosis e MalK1 de Thermus thermophilus não são capazes de energizar os sistemas de transporte AraNPQ e MelEDC, na ausência de MsmX. Contudo, foi verificado que ambas as proteínas não acumulam nas células, muito provavelmente devido a diferenças na utilização de codões entre B. subtilis e M. tuberculosis e T. thermophilus. Adicionalmente, é demonstrado que das ATPases previamente identificadas, ABC_Bt (Bacillus thuringiensis), MsmK (Streptococcus pneumoniae) e ABC_Cd (Clostridioides difficile) são capazes de energizar o transportador MelEDC, enquanto que YurJ (B. subtilis), ABC_Sa (Staphylococcus aureus) e ABC_Syn (Synechocystis sp.) não. Para mapear os domínios funcionais de NBDs multitarefa, uma proteína quimérica MsmXMsmK foi construída e caracterizada. Os resultados demonstram que a quimera é incapaz de energizar os transportadores AraNPQ e MelEDC, mas que acumula na célula, sugerindo que os domínios fundidos não adotam uma conformação adequada resultando numa proteína inativa. Com recurso a um sistema de duplo-híbrido bacteriano (BACTH) em Escherichia coli, é adicionalmente demonstrado que YurJ parece não ser capaz de formar homodímeros nem heterodímeros com MsmX na ausência de TMDs. Além disso, os resultados indicam que MsmX apresenta uma forte interação com os TMDs AraP, MelD e GanP, enquanto que YurJ apenas o estabelece com AraP
Importadores ABC Tipo I bacterianos pertencem a uma das maiores e mais diversas superfamílias de transportadores, fazendo uso da ligação e hidrólise de ATP para energizar o transporte de vários substratos através de membranas. Estes transportadores partilham a mesma arquitetura modular de dois domínios transmembranares (TMDs) e duas ATPases ou domínio de ligação a nucleótidos (NBDs). Adicionalmente, os importadores dependem de um domínio auxiliar para a ligação do substrato e entrega do mesmo aos TMDs, a proteína de ligação ao substrato (SBP). MsmX de Bacillus subtilis foi estabelecida como uma ATPase (NBD) multitarefa, capaz de energizar vários importadores ABC de açúcares. Mais recentemente, o nosso laboratório identificou várias ATPases de bactérias, a maioria destas pertencentes ao filo Firmicutes capazes de complementar a função de MsmX nos sistemas de transporte AraNPQ e GanSPQ. Para averiguar o quão abrangente é a existência de ATPases multitarefa, NBDs de bactérias pertencentes a outros filos foram caracterizadas com a intenção de determinar a sua capacidade multitarefa e a permutabilidade interespécie em B. subtilis. Os resultados demonstram que SugC de Mycobacterium tubercolosis e MalK1 de Thermus thermophilus não são capazes de energizar os sistemas de transporte AraNPQ e MelEDC, na ausência de MsmX. Contudo, foi verificado que ambas as proteínas não acumulam nas células, muito provavelmente devido a diferenças na utilização de codões entre B. subtilis e M. tuberculosis e T. thermophilus. Adicionalmente, é demonstrado que das ATPases previamente identificadas, ABC_Bt (Bacillus thuringiensis), MsmK (Streptococcus pneumoniae) e ABC_Cd (Clostridioides difficile) são capazes de energizar o transportador MelEDC, enquanto que YurJ (B. subtilis), ABC_Sa (Staphylococcus aureus) e ABC_Syn (Synechocystis sp.) não. Para mapear os domínios funcionais de NBDs multitarefa, uma proteína quimérica MsmXMsmK foi construída e caracterizada. Os resultados demonstram que a quimera é incapaz de energizar os transportadores AraNPQ e MelEDC, mas que acumula na célula, sugerindo que os domínios fundidos não adotam uma conformação adequada resultando numa proteína inativa. Com recurso a um sistema de duplo-híbrido bacteriano (BACTH) em Escherichia coli, é adicionalmente demonstrado que YurJ parece não ser capaz de formar homodímeros nem heterodímeros com MsmX na ausência de TMDs. Além disso, os resultados indicam que MsmX apresenta uma forte interação com os TMDs AraP, MelD e GanP, enquanto que YurJ apenas o estabelece com AraP
Descrição
Palavras-chave
Bacillus subtilis ABC Type I sugar importers Multitask ATPases MsmX NBDs interspecies exchangeability BACTH system Importadores de açúcares ABC tipo I ATPases multitarefa Permutabilidade interespécie de NBDs Sistema BACTH