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Publicação
Structural and functional studies of the drug metabolizing enzyme, human aldehyde oxidase
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Resumo(s)
Human aldehyde oxidase (hAOX1; EC 1.2.3.1) is a cytosolic molybdo-flavoenzyme, mainly expressed in liver and adipose tissue. Due to its well-established role in phase I of drug metabolism, this enzyme has gained significant interest to pharmaceutical companies. hAOX1 presents a broad substrate specificity, catalysing the oxidation of various aldehydes and N-heterocycles, the hydrolysis of amide bonds, and the reduction of nitro and S/N-oxides. Despite extensive studies, the mechanism by which this enzyme catalyses substrate reduction remains poorly understood, and the exact location where the reaction occurs is still uncertain, although the FAD site has been proposed as a candidate. Moreover, the physiological role of hAOX1 is still unknown, even though some studies have shown its relevance in certain conditions and pathways, such as adipogenesis. In this work, a Yeast Two-Hybrid (Y2H) screening was performed to search for interacting partners of hAOX1 and unveil potential physiological roles. 17 potential interacting partners were identified, one involved in fat metabolism. hAOX1 harbours a flexible loop that contains two pairs of highly conserved vicinal cysteines and whose function is not acknowledged. To understand the function of the conserved loop, a variant of hAOX1 with six cysteines mutated by alanines (hAOX1_6A) was constructed and fluorescence microscopy experiments were performed to analyse its subcellular localisation. The cytosolic nature was confirmed for both variants. Finally, a new crystallisation condition using Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) instead of Dithiothreitol (DTT) as the reducing agent was optimised and successful co-crystallisation of the enzyme with inhibitors and substrates was achieved. TCEP, contrary to DTT, was found to preserve the enzyme’s activity. Three new ternary complexes in the presence of thioridazine were obtained: two with the reduction substrates, 5-nitroquinoline and ziprasidone, and one with the oxidation substrate, phenanthridine. These data suggest that the reduction substrates have affinity to the molybdenum centre.
A Aldeído Oxidase Humana (hAOX1; EC 1.2.3.1) é uma molibdo-flavoenzima citosólica, expressa principalmente no fígado e tecido adiposo. Devido à sua relevância na fase I do metabolismo de fármacos ser bem estabelecida, o interesse nesta enzima tem aumentado significativamente na indústria farmacêutica. A hAOX1 é promíscua em substratos, catalisando a oxidação de aldeídos e N-heterociclos, hidrólise de ligações amida e redução de nitro e S/N-óxidos. Apesar dos extensivos estudos, o mecanismo pelo qual a enzima catalisa reduções permanece pouco compreendido e o local exato de reação é incerto, apesar de o local FAD ter sido proposto. Adicionalmente, a função fisiológica da hAOX1 é ainda desconhecida, embora alguns estudos tenham mostrado a sua importância em determinadas condições e vias de sinalização, como a adipogénese. Neste trabalho, foi realizado um rastreio por Sistema de dois Híbridos (Y2H), de forma a procurar parceiros de interação da hAOX1 e desvendar potenciais papéis fisiológicos. Identificamos 17 potenciais parceiros, estando um deles envolvido no metabolismo de gorduras. A hAOX1 possui um ‘loop’ flexível composto por cisteínas vicinais, altamente conservadas, cuja função ainda não é conhecida. Para perceber a função deste ‘loop’, uma variante da hAOX1 com 6 cisteínas mutadas por alaninas (hAOX1_6A) foi construído e foram realizadas análises da localização subcelular, recorrendo a microscopia de fluorescência. A natureza citosólica da enzima foi confirmada em ambas as variantes. Finalmente, otimizamos uma nova condição cristalográfica na presença de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) ao invés de Ditiotreitol (DTT) como agente redutor e obtivemos co-cristalizações bem-sucedidas da enzima na presença inibidores e substratos. Contrariamente ao DTT, o TCEP preservou a atividade enzimática. Três complexos ternários na presença de tioridazina foram obtidos: dois com substratos de redução, 5-Nitroquinolina e ziprasidona, e um com substrato de oxidação, fenantridina. Estes dados sugerem que os substratos de redução têm afinidade com o centro de molibdénio.
A Aldeído Oxidase Humana (hAOX1; EC 1.2.3.1) é uma molibdo-flavoenzima citosólica, expressa principalmente no fígado e tecido adiposo. Devido à sua relevância na fase I do metabolismo de fármacos ser bem estabelecida, o interesse nesta enzima tem aumentado significativamente na indústria farmacêutica. A hAOX1 é promíscua em substratos, catalisando a oxidação de aldeídos e N-heterociclos, hidrólise de ligações amida e redução de nitro e S/N-óxidos. Apesar dos extensivos estudos, o mecanismo pelo qual a enzima catalisa reduções permanece pouco compreendido e o local exato de reação é incerto, apesar de o local FAD ter sido proposto. Adicionalmente, a função fisiológica da hAOX1 é ainda desconhecida, embora alguns estudos tenham mostrado a sua importância em determinadas condições e vias de sinalização, como a adipogénese. Neste trabalho, foi realizado um rastreio por Sistema de dois Híbridos (Y2H), de forma a procurar parceiros de interação da hAOX1 e desvendar potenciais papéis fisiológicos. Identificamos 17 potenciais parceiros, estando um deles envolvido no metabolismo de gorduras. A hAOX1 possui um ‘loop’ flexível composto por cisteínas vicinais, altamente conservadas, cuja função ainda não é conhecida. Para perceber a função deste ‘loop’, uma variante da hAOX1 com 6 cisteínas mutadas por alaninas (hAOX1_6A) foi construído e foram realizadas análises da localização subcelular, recorrendo a microscopia de fluorescência. A natureza citosólica da enzima foi confirmada em ambas as variantes. Finalmente, otimizamos uma nova condição cristalográfica na presença de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) ao invés de Ditiotreitol (DTT) como agente redutor e obtivemos co-cristalizações bem-sucedidas da enzima na presença inibidores e substratos. Contrariamente ao DTT, o TCEP preservou a atividade enzimática. Três complexos ternários na presença de tioridazina foram obtidos: dois com substratos de redução, 5-Nitroquinolina e ziprasidona, e um com substrato de oxidação, fenantridina. Estes dados sugerem que os substratos de redução têm afinidade com o centro de molibdénio.
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Palavras-chave
Human Aldehyde Oxidase Drug Metabolism Fluorescence Microscopy X-ray crystallography Yeast Two-Hybrid Screening