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Projeto de investigação
iNOVA4Health - Programme in Translational Medicine (iBET, CEDOC/FCM, IPOLFG and ITQB)
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Autores
Publicações
Carbon monoxide modulation of glial cells on cytoprotection
Publication . Pedroso, Daniela Patrícia Martins Dias; Vieira, Helena L. A.; Lopes, Susana Santos
RESUMO: O Acidente Vascular Cerebral (AVC) é uma das maiores causas de mortalidade e morbidade,
ligada a dano cerebral, em todo o mundo. O AVC isquémico ocorre quando a circulação
sanguínea é interrompida, reduzindo os níveis de oxigénio e nutrientes no tecido cerebral.
Após o restabelecimento da corrente sanguínea, o tecido volta a sofrer dano, devido ao
aumento do stress oxidativo. Esta patologia é caracterizada pela presença de stress oxidativo,
inflamação excessiva, excitotoxicidade e, por fim, morte celular. Apesar de existirem terapias
disponíveis, estas terapias não estão focadas no tratamento do tecido cerebral e apresentam
limitações ao nível da sua eficácia e no curto espaço de tempo em que a sua aplicação é
eficiente. Desta forma, o desenvolvimento de novos tratamentos para a isquemia cerebral é
necessário e urgente. Esta tese pretende se focar nas células da glia, de forma a promover a
proteção cerebral, limitando a neuro-inflamação e a morte celular.
Disfunções do sistema nervoso central (SNC) são comummente consideradas como um
problema neuronal. No entanto, as células da glia estão envolvidas na resposta ao stress e a
mecanismos de neuroprotecção; a prevenção da disfunção glial protege o tecido cerebral, em
última análise, contribui para a recuperação do paciente. As células da glia, como por exemplo
os astrócitos e a microglia, representam a maioria das células presente no cérebro. Estas
células são cruciais para a homeostase cerebral, tendo importantes funções no
desenvolvimento e plasticidade sináptica, na resposta inflamatória, suporte metabólico e
sobrevivência neuronal. Os astrócitos têm importantes funções na modulação e maturação
sináptica, suporte metabólico e proteção neuronal contra stress oxidativo e excitotoxicidade.
Uma vez que estão em contante fiscalização do seu microambiente e em contante
comunicação com as células que os rodeiam, os astrócitos são considerados células altamente
sensitivas, capazes de avaliar o meio e atuar rapidamente de forma a garantir a homeostase e
plasticidade do SNC. Por outro lado, a microglia é a população fagocítica e imunocompetente
no SNC, responsável pela resposta inflamatória. Apesar da eficaz resposta inflamatória, após
infeção ou dano, ser decisiva para preservar o funcionamento do SNC, uma resposta
inflamatória prolongada ou exacerbada é uma característica de várias doenças do SNC,
nomeadamente isquemia cerebral. Assim, esta tese pretende contribuir para o
desenvolvimento de abordagens terapêuticas (i) que melhorem a sensitividade dos astrócitos
em relação ao seu microambiente e (ii) que limitem a resposta inflamatória da microglia,
promovendo a homeostase do SNC no contexto desta doença.
O monóxido de carbono (CO) é um gás endógeno que resulta da degradação de grupos heme
pela enzima heme oxigenase. O CO é descrito na literatura como anti-inflamatório, anti apoptótico e capaz de modular o metabolismo celular. Tratamento com doses baixas de CO ou
promoção de produção de CO endógeno limita a morte celular e neuro-inflamação in culturas
de neurónios, astrócitos e microglia, assim como em modelos in vivo de AVC e isquemia
cerebral neonatal. Ainda assim, os parceiros moleculares do CO ainda não estão
completamente descritos. O estudo destes parceiros nos mecanismos protetores do CO irá
permitir um estudo mais aprofundado no papel biológico deste gás, podendo levar ao
desenvolvimento de melhoradas terapias baseadas no CO, em particular para a isquemia
cerebral. Assim, esta tese tem como objetivo entender com maior profundidade os mecanismos
moleculares de proteção promovida pelo CO, em células da glia. O capítulo I introduz
informação publicada relacionada com as células da glia e CO, assim como os seus parceiros
Neuroglobina (Ngb) e cílios primários. O capítulo II tem como objetivo perceber o papel da
Neuroglobina (Ngb) no efeito anti-inflamatório do CO, na microglia, avaliando a relevância da
Ngb da modulação do metabolismo, promovida pelo CO. O capítulo III pretende avaliar a
capacidade do CO de modular os cílios primários de astrócitos, organelos estes que permitem
a fiscalização do microambiente pelas células. Estes dados são posteriormente discutidos no
capítulo IV, sendo também discutidas questões não respondidas por estes resultados e
experiências futuras. Por fim, como anexo, o capítulo V apresenta dados que dizem respeito a
um manuscrito técnico, em preparação, relacionado com de Novo lipogénese. Este manuscrito
foi desenvolvido em colaboração, no âmbito da avaliação da modulação pelo CO do
metabolismo microglial.
Dissecting the role of ral gtpase in neuronal and glial Structure and function
Publication . Rodrigues, Joana Filipa da Silva; Teodoro, Rita; Oliveira, João F.
Abstract
The complexity of the nervous system demands and relies on a diversity of molecular
processes essential for its correct development and functioning. Coordinated growth
and communication between neurons and glia is crucial and indispensable for the
physiological functions of the nervous system. Balanced neuronal and glial interaction
and communication is decisive, for instance, to ensure suitable axonal insulation and
fasciculation. Axonal ensheathment and insulation are critical for fast and reliable
impulse conduction and disturbances in these processes often result in highly
debilitating disorders, such as multiple sclerosis. Despite the obvious importance, our
knowledge regarding the molecular players responsible for controlling the
development, growth and communication between neurons and glia is still somewhat
limited.
In my thesis, we identified RalA GTPase and the exocyst complex as key regulators
of axonal ensheathment in Drosophila melanogaster larval peripheral nerves. Detailed
genetic analysis showed that RalA is required for wrapping glia growth and
development, acting together with its effector exocyst. Our data suggests that this
mechanism is regulated through the activation of the EGF receptor and downstream
signaling, with RalA and the exocyst likely controlling the secretion of the activating
EGFR ligand and/or regulating EGFR endocytic pathway.
In summary, we established RalA GTPase and the exocyst as a novel regulators of
wrapping glia development providing a new perspective of the molecular pathways
governing glia growth and development in the peripheral nervous system. With this,
we expect to contribute for the identification of potential new points of intervention for
potential improvement or development of novel therapies to mitigate symptoms
caused by neurological disorders in which axonal ensheathment and/or Ral GTPase
pathway are impaired.
Towards a bioinspired 3D triculture hiPSC-derived cardiac tissue model for human heart microenvironment recapitulation and drug testing
Publication . Costa, Pedro Gustavo Marchã Canhão; Alves, Paula; Serra, Maria Margarida
Assessment of the Potential of Using Nanofiltration Polymeric and Ceramic Membranes to Treat Refinery Spent Caustic Effluents
Publication . Rita, Ana Isabel; Nabais, Ana Rita; Neves, Luísa A.; Huertas, Rosa; Santos, Maria; Madeira, Luís M.; Sanches, Sandra; DQ - Departamento de Química; LAQV@REQUIMTE; MDPI AG
Spent caustic effluents are very challenging due to their very hazardous nature in terms of toxicity as well as their extreme pH (approximately 12–14). Spent caustic has presented a challenge for wastewater treatment in refineries, due to its composition rich in mercaptans, sulfides and other aromatic compounds. To address such problems, membrane filtration was studied using real effluents from Sines Refinery, in Portugal. The present study attempts to assess the potential for spent caustic treatment with nanofiltration (NF) polymeric and ceramic membranes, assessing membrane life expectancy. For that, membrane aging studies in static mode were performed with the polymeric membrane before attempting NF treatment (dynamic studies). A ceramic membrane was also tested for the first time with this type of effluents, though only in dynamic mode. Although the polymeric membrane performance was very good and in accordance with previous studies, its lifespan was very reduced after 6 weeks of contact with spent caustic, compromising its use in an industrial unit. Contrarily to expectations, the ceramic membrane tested was not chemically more resistant than the polymeric one upon direct contact with spent caustic (loss of retention capacity in less than 1 h in contact with the spent caustic). The results obtained suggest that a pH of 13.9 is very aggressive, even for ceramic membranes.
Calcium role in activity dependent bouton formation
Publication . Augusto, Pedro Miguel Matias; Teodoro, Rita
RESUMO: A plasticidade sináptica é um mecanismo intrínseco do sistema nervoso, essencial para modificar e criar novas conexões sinápticas, suportando processos neuronais como a aprendizagem e memória. A
conectividade neuronal é maioritariamente geneticamente determinada; no entanto, os neurónios também
podem remodelar a sua morfologia adicionando ou eliminando estruturas sinápticas em resposta à atividade.
Defeitos nesta forma de plasticidade estrutural estão descritos como sendo a causa de várias doenças
neurodegenerativas. Embora algumas vias de sinalização envolvidas neste processo já tenham sido
identificadas, como é que a atividade induz mudanças estruturais e como é que deficiências nesses
mecanismos podem levar à doença, está longe de ser compreendido. Desta forma, o nosso objetivo é estudar
como os neurónios alteram sua estrutura em resposta à atividade e identificar as vias que regulam esse
processo.
Utilizamos a junção neuromuscular da Drosophila melanogaster como modelo para plasticidade estrutural,
pois a sua morfologia é estereotipada, mas exibe uma plasticidade estrutural robusta, o que permite o estudo
do mecanismo pelo qual os neurónios crescem a alteram a sua forma. Resultados recentes do laboratório
indicam que novas estruturas pré-sinápticas (botões sinápticos) emergem rapidamente (em segundos) com
uma morfologia arredondada, associados a intensa contração muscular. Foi também demostrado que, ao
contrário dos processos de migração mediada por cones de crescimento, a formação de botões em resposta
a atividade assemelha-se mais com um mecanismo diferente, chamado de blebbing . Blebs são protusões de
membrana induzidas por pressão, e resultantes da contração do córtex de actina através de motores de
miosina. Alguns estudos mostraram que a alta contratilidade é acompanhada por variações cíclicas de Ca2+
intracelular e, mesmo em alguns casos, esse aumento no Ca2+ precede o aparecimento de blebs. Tendo isto
em consideração, colocámos como hipótese se o Ca2+ poderia ser o sinal que inicia a formação local de botões
sinápticos, fornecendo especificidade temporal e espacial.
Para testar esta hipótese, fizemos vídeos de microscopia de larvas de Drosophila expressando um marcador
de membrana neuronal juntamente com um sensor de cálcio geneticamente codificado, GCamP6f. Para
induzir atividade realizamos protocolos de despolarização neuronal usando soluções com alta concentração
em K+ e Ca2+. Estes protocolos estão bem descritos como suficientes para induzir a remodelação pré-sináptica
em apenas alguns minutos após a estimulação. Observamos que todos os eventos de formação e retração
de botões são precedidos por um aumento repentino e de grande magnitude no Ca2+ intracelular. A diferença
entre esses dois fenómenos foi que, enquanto na formação de botões, o sinal GCaMP6f é sustentado no novo
botão, na retração do botão o sinal dissipa-se rapidamente após o aumento repentino. Uma vez que se sabe
que elevações de Ca2+ podem regular a contração do córtex de actina, estes resultados sugerem que a
formação e a retração de botões podem ter um mecanismo de iniciação comum através da regulação da
miosina. O facto de os novos botões terem um sinal GCaMP6f elevado e prolongado (em oposição às
estruturas retraídas ) pode refletir a remodelação do citoesqueleto celular ou o recrutamento de vesículas
sinápticas.
Para entender qual a fonte do sinal de Ca2+, manipulamos as concentrações extracelulares deste ião e os
canais de Ca2+ nos neurónios motores, sempre no contexto de protocolos de atividade. Existem vários canais
que estão descritos como cruciais, não apenas para a migração neuronal, mas também para a atividade
neuronal. Além disso, o Ca2+ citoplasmático também é influenciado por organelos como o retículo
endoplasmático e mitocôndrias. Os nossos dados sugerem que a regulação negativa dos canais de Ca2+
dependentes da voltagem nos neurónios motores não afeta significativamente a formação de novos botões.
Por outro lado, o aumento intracelular de Ca2+ pela regulação negativa de uma ATPase de Ca2+ do retículo
aumenta a formação de botões, o que implica que diferentes origens de Ca2+ podem contribuir de maneira
diferente para alterações pré-sinápticas durante a atividade.
Este estudo expande a nossa compreensão dos mecanismos que controlam o crescimento pré-sináptico num
neurónio num sistema in vivo. Potencialmente, este trabalho pode contribuir para entender como a
plasticidade estrutural neuronal pode ser manipulada e usada como estratégia neuroprotetora para tratar
doenças em que haja perda neuronal.
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