Grosso, Ana RitaPóvoa, VandaMatos, João Lourenço Pereira de2026-01-222026-01-222025-12-11http://hdl.handle.net/10362/199656O cancro da mama triplo negativo (TNBC) é um subtipo agressivo caracterizado por elevada heterogeneidade, ausência de terapias alvo e remodelação extensa do microambiente tumoral (TME). Agentes antiangiogénicos como o bevacizumab podem reduzir a expansão tumoral, mas os mecanismos de resistência e modulação imunitária permanecem pouco esclarecidos. Xenógrafos de peixe-zebra constituem um modelo in vivo versátil para investigar estes processos em resolução celular. Para garantir análises fiáveis de sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq), foram comparadas estratégias de dissociação e fixação (células vivas, metanol, ACME) em xenógrafos da linha de TNBC Hs578T. Comparativamente ao protocolo com células vivas, a fixação por ACME revelou uma maior recuperação celular e preservação da integridade transcriptómica, enquanto o metanol manteve igualmente padrões de expressão génica e constitui uma alternativa válida. A scRNA-seq de xenógrafos a um e quatro dias pós-injeção, sob tratamento com PBS ou bevacizumab, identificou três estados tumorais principais: proliferativo, quiescente e inflamatório. O bevacizumab reduziu a população proliferativa e promoveu um programa inflamatório enriquecido em vias TNF, NF-κB e IL-17. A análise de comunicação célula–célula a um dia pós-injeção revelou aumento da sinalização de tumor para macrófagos através de ligandos da matriz extracelular que ativam o sindecano-4 (SDC4) em macrófagos associados ao tumor (TAMs). Estes resultados suportam um modelo em que o bloqueio de VEGF-A induz reprogramação inflamatória e remodelação da matriz, potenciando a retenção e polarização dos TAMs mediada por SDC4. No seu conjunto, este trabalho estabelece protocolos otimizados de scRNA-seq em xenógrafos em peixe-zebra e fornece nova perspetiva mecanística sobre a resistência induzida por bevacizumab no TNBC.Triple-Negative Breast Cancer (TNBC) is an aggressive subtype characterized by heterogeneity, absence of targeted therapies, and extensive tumor microenvironment (TME) remodeling. Anti-angiogenic agents such as bevacizumab can reduce tumor burden, but mechanisms of resistance and immune modulation remain poorly defined. Zebrafish xenografts provide a versatile in vivo model to investigate these processes at single-cell resolution. To enable reliable single-cell RNA sequencing (scRNA-seq), dissociation and fixation strategies (live, methanol, ACME) were compared in Hs578T TNBC xenografts. Compared to the live protocol, ACME fixation yielded higher cell recovery and preserved transcriptomic integrity, while methanol also preserved gene expression and represents a valid alternative. scRNA-seq of xenografts at one and four days post-injection, under PBS or bevacizumab treatment, identified three major tumor states: proliferative, quiescent, and inflammatory. Bevacizumab reduced the proliferative population while promoting an inflammatory program enriched in TNF, NF-κB, and IL-17 signaling. Cell–cell communication analysis at one day post-injection revealed increased tumor-to-macrophage signaling through extracellular matrix ligands activating SDC4 in TAMs. These results support a model where VEGF-A blockade induces inflammatory reprogramming and extracellular matrix remodeling, enhancing SDC4-mediated TAM retention and polarization. κ Altogether, this work establishes optimized scRNA-seq protocols for zebrafish xenografts and provides mechanistic insight into bevacizumab-induced resistance in TNBC.engTriple-Negative Breast CancerTumor-Associated MacrophagesSingle-Cell RNA SequencingBevacizumabZebrafish Xenograftsmaster thesis