MARTINS, Maria da LuzSILVA, João InácioELÓI, Marisa Isabel Benedita Simões2016-10-242016-10-2420092009http://hdl.handle.net/10362/19230As aspergiloses são cada vez mais diagnosticadas em todo o mundo, nas suas diversas formas de apresentação, tanto pelo aumento da população susceptível como pela melhoria dos métodos de diagnóstico laboratorial. Estas infecções fúngicas são causadas por algumas espécies do género Aspergillus. A espécie A. fumigatus continua a ser a causa mais frequente de Aspergilose Invasiva. No entanto, outras espécies como A. flavus, A. terreus, A. niger, A. nidulans e A. versicolor têm sido relacionadas com patologias no Homem. Estão descritos diversos casos em que estas espécies se têm tornado resistentes à medicação e, por esta razão, tem sido também muito importante a sua rápida e correcta identificação. Um grande número de indivíduos é passível de cura após um diagnóstico nas fases iniciais da infecção e após aplicação dos tratamentos mais adequados. Actualmente, as técnicas convencionais de diagnóstico são morosas devido ao facto do fungo Aspergillus demorar vários dias a crescer. Em adição, a identificação do fungo é depois muitas vezes dificultada devido à ambiguidade de muitas das características fenotípicas usadas na delimitação das espécies. O principal objectivo deste trabalho foi desenvolver um método baseado em PCR que permitisse identificar as principais espécies de Aspergillus clinicamente relevantes: A. fumigatus, A. flavus, A. terreus, A. niger, A. nidulans e A. versicolor. O primeiro passo foi optimizar um método de extracção de DNA genómico mais eficiente para estas espécies, tarefa que se revelou bem mais complexa e demorada do que o inicialmente previsto. O segundo passo envolveu o desenho de sistemas de primers específicos para cada espécie, baseados na análise das regiões ITS (Internal Trancribed Spacers 1 e 2 e região 5.8S) do seu genoma, e a sua utilização em reacções de PCR. Os resultados preliminares obtidos com os primers desenhados revelaram-se promissores para a identificação das várias espécies, mas as reacções de PCR requerem ainda alguma optimização para melhoramento da sua especificidade. A utilização futura destes primers em reacções de PCRmultiplex para a identificação simultânea das várias espécies de Aspergillus poderá assim vir a ser possível.The aspergillosis are more than ever diagnosed all over the world being presented in several ways, this is due to the sensitive population as well as better laboratory diagnostic methods. These yeast infections are caused by certain species of Aspergillus genus. The specie A. umigatus still continues to be the most frequent cause of Invasive Aspergillosis. Other species such as A. flavus, A. terreus, A. niger, A. nidulans e A. versicolor have been related to the pathologies in Man. There are certain written cases where these species have become resistant to medication and for this reason has also been very important to identify it quickly and correct. A huge number of patients are able to be cured if it is diagnosed from an early stage of the infection and after applying adequate treatment. The present conventional diagnostic techniques last a long time due to the fact the Aspergillus fungi take several days to grow. In addition to this the identification of the fungi is also very difficult due the ambiguous phenotypic characteristics used in species definition. The aim of this work was to develop a method based on PCR which would allow us to identify the species of Aspergillus relevant to main clinics. The first step was to optimize the extraction of genomic DNA method which would be more efficient for these species. This task became more complex and took longer than initially foreseen. The second step involved the design of specific primers for each specie based on ITS regions (Internal Trancribed Spacers 1 and 2 and region 5.8S) analyses of its genome, as well as their use in PCR reactions. The preliminary results obtained with the designed primers revealed to be promising for the identification of these several species, although PCR reactions still require further optimization. The future use of these primers in PCRmultiplex reactions for the simultaneous identification of several Aspergillus species will be possible.porBiologia molecularFungosaspergillusIdentificaçãomaster thesis