Filipe, SérgioFernandes, Ana Carolina Fuente2024-01-312024-01-312023-11http://hdl.handle.net/10362/162940Streptococcus pneumoniae, a gram-positive bacterium has become a significant human patho- gen worldwide, due to its resistance to penicillin and various antibiotics. One of the key mechanisms contributing to the genetic diversity and adaptation of Streptococcus pneumoniae is its ability to undergo natural transformation, a process that allows horizontal gene transfer, facilitating the acquisition of new genetic material, such as antibiotic-resistance genes. In Streptococcus pneumoniae, penicillin resistance requires the expression of mosaic penicillin- binding proteins, which remain active despite the antibiotic’s presence. However, it has been reported that the production of non-ribosomal murMN transferases, responsible for peptidoglycan ramification, influences the expression of penicillin resistance. These enzymes are encoded in the murMN operon, which plays a vital role in cell wall biosynthesis and maintenance, penicillin resistance, and antibiotic tolerance. This dissertation aimed to construct Pen6ΔmurMN mutant strains carrying specific mutations in their chromosome and investigate their influence on the bacterial cell surface composition, resistance to penicillin, morphology, or division. To achieve this, we first determined the parameters that maximize the co-transformation of different DNA fragments with or without different resistance markers, in the Pen6 parental strain. We observed that co-transformation was only successful when the DNA fragments encoding the rpsL* selection marker and the reporter were fused. As the surprisingly low frequency of co-transformation could be associated with an abnormal cell wall composition, enriched with branched muropeptides, a comparative analysis of the ability of the Pen6 and Pen6ΔmurMN strains to transform DNA was conducted. The results showed that the Pen6ΔmurMN strain has a significantly lower transformation effi- ciency when compared to the parental strain. Analysis of the transformation ability of different Pen6ΔmurMN mutant strains suggests that the presence of branched peptidoglycan on the pneumococcal cell surface, or of the murMN operon, plays an important and undisclosed role in pneumococcal trans- formation and horizontal gene transfer.Streptococcus pneumoniae, uma bactéria gram-positiva, tornou-se um patógeno humano de im- portância global, devido à sua resistência à penicilina e outros antibióticos. A capacidade de sofrer transformação natural é um dos principais mecanismos que contribuem para a adaptação e diversidade genética desta bactéria, permitindo a aquisição de novo material genético, como genes de resistência a antibióticos. Em Streptococcus pneumoniae, a resistência à penicilina requere a expressão de proteínas de ligação à penicilina mosaico, que permanecem ativas, apesar da presença de antibióticos. No entanto, foi reportado que a produção de murMN transferases não-ribossómicas, responsáveis pela ramificação do peptidoglicano, influencia a resistência à penicilina. Estas enzimas, codificadas pelo operão murMN, têm um papel importante na síntese da parede celular, resistência à penicilina, e tolerância a antibióticos. Esta dissertação teve como objetivo construir estirpes mutantes de Pen6ΔmurMN que incluíam diferentes mutações no seu cromossoma, permitindo investigar a sua influência na composição da su- perfície celular da bactéria, resistência à penicilina, morfologia e divisão celular. Inicialmente, foram determinados os parâmetros que maximizavam a co-transformação de diferentes fragmentos de DNA, com ou sem marcadores de resistência, para a estirpe parental Pen6. Observou-se que a co-transforma- ção foi bem-sucedida apenas quando se fundiram os fragmentos de DNA que codificam o marcador seletivo rpsL* e o repórter. Devido à baixa frequência de co-transformação, possivelmente relacionada com a composição anormal da parede celular, enriquecida com muropéptidos ramificados, realizou-se uma análise comparativa da habilidade das estirpes Pen6 e Pen6ΔmurMN de transformar DNA. Os resultados demostraram que a estirpe Pen6ΔmurMN apresenta uma eficiência de transfor- mação significativamente inferior, quando comparada com a estirpe parental. A análise de diferentes estirpes mutantes de Pen6ΔmurMN sugeriu que a presença de peptidoglicano ramificado na superfície celular de pneumococos, ou do operão murMN, tem um papel importante e não revelado na transforma- ção e transferência horizontal de genes, em pneumococos.engStreptococcus pneumoniaenatural transformationmurMN operonbranched peptidoglycantransformation efficiencymaster thesis