MACEDO, Ana RitaCARNEIRO, SofiaRODRIGUES, Joana Inês Conceição2024-04-112025-01-112023-102023-10http://hdl.handle.net/10362/166110Nos últimos anos, as infeções provocadas por micobactérias não tuberculosas (MNTs) têm-se revelado um problema crescente de saúde pública. O aumento de casos verifica-se sobretudo em países desenvolvidos com uma diminuição na incidência de tuberculose (TB). As MNTs são ubíquas no ambiente, e apresentam como principais reservatórios sistemas de água, solo e vegetação, afetando uma grande variedade de hospedeiros, incluindo o ser humano. Em particular, as espécies do complexo Mycobacterium avium (MAC) têm sido as principais responsáveis pelo aumento de casos de doença humana por MNTs. Do ponto de vista clínico, estas infeções estão associadas a linfoadenopatia periférica em crianças, e, em adultos, manifestam-se sobretudo a nível respiratório, podendo também ocorrer, principalmente em indivíduos imunocomprometidos, infeção disseminada. Atualmente, o modo de transmissão ainda não está totalmente esclarecido, contudo, a exposição a fontes ambientais contaminadas é considerada a principal via de infeção. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização da diversidade genética e do perfil de resistência de estirpes MAC circulantes em Portugal. Para isso, foram analisadas 142 estirpes clínicas (de um total de 616 isolados MAC) isoladas no Laboratório Nacional de Referência para a Tuberculose (LNR-TB) do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA), nos últimos oito anos. Em 134 (94,4%) estirpes, foram realizados testes de suscetibilidade fenotípica à claritromicina (CLR), moxifloxacina (MOX) e linezolide (LNZ). Do total das estirpes testadas fenotipicamente, 93,2% (n=125) apresentaram suscetibilidade à CLR, enquanto apenas 49,3% (n=66) e 41,8% (n=56) foram fenotipicamente suscetíveis ao LNZ e MOX, respetivamente. A resistência ao LNZ foi mais frequente em M. avium (40%) e M. intracellulare (40%) do que em M. chimaera (10,4%) (p<0,05). Adicionalmente, a espécie M. avium (41,8%) mostrou-se significativamente mais resistente à MOX do que M. chimaera (20,8%) (p<0,05). Adicionalmente, foram realizados testes moleculares, por pesquisa de mutações nos genes 16S rRNA (rrs) e 23S rRNA (rrl), associadas a resistência a aminoglicosídeos e macrólidos, respetivamente. Verificou-se uma elevada correlação entre os resultados fenotípicos e genotípos relativamente aos macrólidos (CLR). De forma semelhante, por não apresentarem mutações nas posições associadas a resistência, todos os isolados serão presuntivamente suscetíveis aos aminoglicosídeos. Curiosamente, algumas estirpes apresentaram populações heterogéneas na posição G1491G/A do gene rrs, sendo que a mutação G1491A ainda não está descrita em MAC como eventual marcador de resistência. As estirpes em estudo foram caracterizadas quanto à sua diversidade genómica, através de metodologias de tipagem molecular baseadas na análise de MIRU-VNTR. Nesta análise foi possível verificar uma elevada diversidade genética entre as estirpes de M. avium (2 clusters e 53 singletons) e M. intracellulare (3 clusters e 26 singletons), e uma diversidade expressivamente menor em M. chimaera (5 clusters e 6 singletons). Globalmente, a metodologia MIRU-VNTR obteve um índice discriminatório de 0.9988 para as espécies M. avium e 0.9214 para M. intracellulare/M. chimaera. Curiosamente, 31 (63%) dos doentes com estirpes M. chimaera, residem na região de Setúbal. Contudo, como o LNR-TB não tem acesso a dados demográficos/clínicos, ainda que vários clusters sejam formados por estirpes da mesma região geográfica, estes são insuficientes para confirmar relações epidemiológicas entre os casos.In recent years, opportunistic infections caused by nontuberculous mycobacteria (NTMs) have gained increased importance in public health. The increase in cases is mostly seen in developed countries with a decrease in the incidence of tuberculosis (TB). NTMs are ubiquitous in the environment and their main reservoirs are water systems, soil and vegetation, affecting a wide range of hosts, including humans. In particular, species of the Mycobacterium avium complex (MAC) have been mainly responsible for the increase in cases of human disease caused by NTMs. From a clinical point of view, these infections are linked to peripheral lymphadenopathy in children, and in adults, they manifest primarily at the respiratory level, and disseminated infection can also occur, especially in immunocompromised individuals. Currently, the mode of transmission it is not established, however exposure to contaminated environmental sources is considered the main route of infection. The aim of this study was to characterize the genetic diversity and resistance profile of MAC strains circulating in Portugal. To this end, 142 clinical strains (out of a total of 616 MAC isolates) isolated at the National Reference Laboratory for Tuberculosis (LNR-TB) of the Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA) over the last eight years were analyzed. Phenotypic susceptibility tests to clarithromycin (CLR), moxifloxacin (MOX) and linezolid (LNZ) were carried out on 134 (94%) strains. Of all the strains tested phenotypically, 93,2% (n=125) showed susceptibility to CLR, while only 49.3% (n=66) and 41.8% (n=56) were phenotypically susceptible to LNZ and MOX, respectively. Resistance to LNZ was more frequent in M. avium (40%) and M. intracellulare (40%) than in M. chimaera (10,4%) (p<0.05). Additionaly, the M. avium species (41,8%) were significantly more resistant to MOX than M. chimaera (20,8%) (p<0,05). Futhermore, molecular tests were carried out, by screening of mutations in the 16S rRNA (rrs) and 23S rRNA (rrl) genes, associated with resistance to aminoglycosides and macrolides, respectively. For macrolides (CLR) there was a high correlation between the phenotype and genotype outcomes. Similarly, because there were not mutations in the positions associated with resistance, all isolates are presumed to be susceptible to aminoglycosides. Interestingly, some strains showed heterogeneous populations at position G1491G/A of the rrs gene, and the G1491A mutation has not yet been described in MAC as a possible resistance marker. The genetic diversity of the strains was characterized using molecular typing methodologies based on MIRU-VNTR analysis. This analysis revealed a high level of genetic diversity among the strains of M. avium (2 clusters and 53 singletons) and M. intracellulare (3 clusters and 26 singletons), and significantly less diversity in M. chimaera (5 clusters and 6 singletons). Overall, the MIRU-VNTR methodology obtained a discriminatory index of 0,9988 for the M. avium and 0,9214 for M. intracellulare/M. chimaera. Interestingly, 31 (63%) of the patients with M. chimaera strains live in Setúbal region. However, as the LNR-TB does not have access to demographic/clinical data, even though several clusters are formed by strains from the same geographical region, the available data is insufficient to confirm epidemiological relationships between cases.porCiências biomédicasBiologia molecularMedicina tropical e internacionalComplexo Mycobacterium avium (MAC)GenotipagemMIRU-VNTRTestes de suscetibilidade antimicrobianaVigilância laboratorialPortugalmaster thesis203544811