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Título: Characterization of the Hepatitis Delta Virus Small Antigen: Intracellular Localization, Structure, Multimerization and RNA Binding Ability
Autor: Alves, Carolina Alpalhão Mantero de Mendonça
Orientador: Cunha, Celso
Taylor, Emeritus John
Palavras-chave: vírus da hepatite delta, antigénio delta pequeno, desordem intrínseca de proteínas, multimerização de proteínas, ligação proteína-ácidos nucleicos
Data de Defesa: 2013
Resumo: O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente patogénico responsável por uma das formas mais severas de hepatite viral. O genoma consiste numa molécula circular de RNA de cadeia simples de polaridade negativa e apresenta uma única proteína viral, o antigénio delta pequeno (S-HDAg). Na sequência de um mecanismo de editing outra proteína viral é traduzida, o antigénio delta grande (L-HDAg). Apesar de partilharem grande parte da sua sequência, as duas proteínas desempenham funções distintas. O S-HDAg é essencial para a acumulação de RNAs virais enquanto o L-HDAg inibe a replicação viral e é necessário para o empacotamento. O HDV depende extensivamente de factores do hospedeiro para completar o seu ciclo de replicação. Pensa-se que a polymerase II (pol II) do hospedeiro é redireccionada para transcrever o RNA viral. No presente trabalho procurou-se caracterizar o S-HDAg e clarificar o seu papel no ciclo de replicação do HDV. Observamos que quando o S-HDAg é expresso na presença de replicação do RNA viral, o antigénio co-localiza com a pol II. Contudo, a co-localização com pol II verifica-se mesmo na presença de RNA viral incapaz de ser replicado e na ocorrência de inibição da replicação viral, sugerindo que o S-HDAg não participa directamente na transcrição do RNA viral. Assim, propomos que o S-HDAg é essencial para acumulação de RNAs virais protegendo ou estabilizando os RNAs. Observamos ainda que na ausência de RNA viral o S-HDAg co-localiza com a nucleolina nos nucléolos. Contudo, na presença de RNA incapaz de ser replicado, o antigénio desloca-se para o nucleoplasma mantendo-se a nucleolina nos nucléolos, sugerindo que o S-HDAg não interage directamente com a nucleolina. Ao estudarmos as características estruturais do S-HDAg verificámos, utilizando um preditor de desordem intrínseca, que apresenta um elevado grau de desordem. A previsão foi confirmada in vitro por dicroísmo circular observando-se que apenas 30% dos amino ácidos adoptam uma conformação de hélice . A ausência de uma estrutura rígida pode conferir ao antigénio flexibilidade para se adaptar a diferentes parceiros e participar em vários passos do ciclo de replicação viral. A multimerização do S-HDAg foi analisada por dispersão de luz dinâmica. Os resultados indicam que o antigénio recombinante purificado é capaz de formar multímeros de 12 moléculas. Adicionalmente, foram observados multímeros de seis a oito moléculas em gel de poliacrilamida desnaturante, após cross-linking. Os mesmos multímeros foram observados para S-HDAg presente em partículas virais sugerindo que a multimerização do antigénio ocorre in vivo. Finalmente, estudamos a capacidade do S-HDAg interagir com ácidos nucleicos. Verificamos que multímeros e monómeros de S-HDAg são capazes de interagir in vitro com RNA e DNA. A falta de especificidade observada pode dever-se apenas a interacções electrostáticas entre o S-HDAg de carga positiva (+12) e ácidos nucleicos de carga negativa. Propomos que, in vivo, a fosforilação extensiva do S-HDAg reduza a carga positiva contribuindo para que a interacção seja específica para os RNAs virais.
URI: http://hdl.handle.net/10362/19280
Designação: DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS, ESPECIALIDADE DE BIOLOGIA MOLECULAR E CELULAR
Aparece nas colecções:IHMT: MM - Teses de Doutoramento

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