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Título: Resistência mediada por efluxo em Escherichia coli: novas estratégias terapêuticas utilizando antibióticos e inibidores do efluxo
Autor: PINTO, Antónia Rosa Trindade
Orientador: VIVEIROS, Miguel
COUTO, Isabel
Palavras-chave: Ciências biomédicas
Microbiologia médica
Sistemas de efluxo
Resistência aos antibióticos
E. coli
Cloropromazina
Ortovana
Antibióticos
Data de Defesa: 2012
Resumo: As bactérias desenvolveram ao longo do tempo, mecanismos que lhes permitem superar os efeitos nocivos causados por uma grande variedade de compostos antimicrobianos. Os sistemas de efluxo e a permeabilidade reduzida da parede celular são dois desses mecanismos. Para se estudar a resistência aos antibióticos mediada por efluxo em Escherichia coli, a influência dos inibidores de efluxo na resistência, os mecanismos de acção desses inibidores, a sua relação com a bioenergética e a competição entre substratos de efluxo, usaram-se duas estirpes de E. coli: a estirpe AG100, com o sistema de efluxo AcrAB-TolC funcional, e a estirpe AG100A, com o sistema AcrAB-TolC inactivo. Os inibidores testados foram a cloropromazina, tioridazina, ortovanadato sódio, arilpiperazina, carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona e o verapamil. Estes compostos foram avaliados i) quanto à sua capacidade para inibir o sistema de efluxo AcrAB-TolC, através de um método fluorométrico semi-automático; ii) quanto à capacidade para diminuírem a susceptibilidade de E. coli aos antimicrobianos, através da determinação de concentrações mínimas inibitórias na presença e ausência de inibidores de efluxo; iii) quanto ao seu efeito ao nível da membrana celular, nomeadamente, disrupção do potencial de membrana, por microscopia de fluorescência. Para além disso, estes inibidores foram usados em ensaios de competição entre o brometo de etídio e os antibióticos tetraciclina, ofloxacina e oxacilina. Os resultados demonstraram que todos os compostos estudados foram capazes de diminuir a actividade de efluxo. Os compostos que apresentaram um efeito mais relevante foram a cloropromazina e o ortovanadato sódio. Contrariamente, as arilpiperazinas demonstraram um maior efeito na redução dos valores das concentrações mínimas inibitórias dos antibióticos testados realçando o facto de que o efeito destes compostos tidos como inibidores nem sempre corresponde à inibição real de efluxo. Para além disso, foi possível dividir os inibidores em dois grupos: (i) dependentes da acção da glucose – NMP e VP, e (ii) independentes da acção da glucose – CCCP, CPZ, Na3VO4. Os resultados de microscopia de fluorescência demonstraram que todos os compostos testados possuem um efeito imediato ao nível da produção de energia celular, afectando o potencial de membrana. Por último, os ensaios de competição entre substratos demonstraram a existência de um efeito sinérgico, nomeadamente com tetraciclina e ofloxacina, uma vez que permitiram a retenção de mais brometo de etídeo no interior das células. Os resultados obtidos evidenciam a relação entre a resistência aos antibióticos por efluxo activo em E. coli, em particular pelo sistema AcrAB-TolC, e a sua dependência de energia fornecida pela hidrólise de ATP. Deste modo, podemos concluir que os inibidores de efluxo podem ser potenciais alvos para o desenvolvimento de novas terapias no combate à resistência em E. coli.
Bacteria developed mechanisms that allow overcoming the noxious effects caused by a wide variety of compounds. Two of these strategies are the increase of the activity of efflux pumps and the reduced permeability of the cell wall. This work aims to contribute to: (i) a better understanding of efflux inhibitors mechanisms of action; (ii) correlate the mechanisms of action these efflux inhibitors with bioenergetic alterations at cell wall level; iii) study the competition between efflux pumps substrates and, (iii) evaluate, in vitro, combinations of antibiotics and efflux inhibitors that have the capacity to inhibit efflux pumps activity in Escherichia coli. For that, we used two E. coli strains: strain AG100, which has the efflux system AcrAB-TolC active, and strain AG100A, with AcrAB-TolC inactivated. The efflux inhibitors tested were chlorpromazine, thioridazine, sodium orthovanadate, arylpiperazin, carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone (CCCP) and verapamil. These compounds were assayed i) for their capacity to inhibit the efflux system AcrAB-TolC by a semi-automated fluorometric method; ii) for their ability to decrease the susceptibility for the antibiotics through minimal inhibitory concentration determination in presence and absence of efflux inhibitors; and iii) for their effect on the cell membrane, namely, disruption of the membrane potential, evaluated by fluorescence microscopy. Also, these efflux inhibitors were used in competition assays between ethidium bromide and the antibiotics tetracycline, ofloxacin and oxacilin. The results demonstrated that all inhibitors provide efflux inhibition. Chlorpromazine and sodium orthovanadate were the two efflux inhibitors with more capacity to inhibit real-time efflux of ethidium bromide. Conversely, in the reduction in the minimal inhibitory concentration values of the antibiotics tested, the arylpiperazin was the most effective inhibitory agent highlighting the fact that minimal inhibitory concentration reduction effects of putative efflux inhibitors not always reflect a real efflux-pump inhibition. Moreover, the results allow us to divide the efflux inhibitors in two groups: (i) those that are dependent of glucose – arylpiperazin and e verapamil, and (ii) those that are independent of glucose – CCCP, cholpromazine and sodium orthovanadate. The results obtained with the fluorescence microscopy show that all the compounds tested have an immediate effect on the production of cellular energy, affecting the membrane potential. Moreover, the results obtained further supports the conclusion that combinations of antibiotic plus efflux inhibitors results in a synergistic effect allowing the retention of more ethidium bromide inside the cells. This study revealed the relation between E. coli antibiotic resistance and active efflux, in particular by the AcrAB-TolC system, and its dependence on the energy provided by the hydrolysis of ATP. In conclusion, efflux inhibitors might be a new potential target for the development of new synergistic therapies to combat antibiotic resistance in E. coli.
URI: http://hdl.handle.net/10362/14014
Designação: Dissertação para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Biomédicas
Aparece nas colecções:IHMT: MM - Dissertações de Mestrado

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