Clonagem, sobre-expressão, purificação e caracterização bioquímica da proteína MreB de Marinobacter hydrocarbonoclasticus

Abstract

A actina, um componente central do citoesqueleto eucariótico, é responsáve lpela manutenção da forma celular, entre outras funções.Pensava-se que, em procariotas, este tipo de proteínas não existia, dado que estudos preliminares não haviam detetado elementos do citoesqueleto. No entanto, foram já identificadas homólogas estruturais e funcionais da actina em bactérias, nomeadamente a MreB, uma proteína do citoesqueleto de procariotas com uma estrutura helicoidal associada à membrana celular,envolvida na determinação da forma de células em bastonete. Com base nas características destas proteínas, supõe-se que a função biológica será semelhante à actina. Neste trabalho, realizou-se a clonagem da MreB de Marinobacter hydrocarbonoclasticusno vetor de expressão pET-22b(+), sobre-expressão em meio LB (condições ótimas de crescimento: 37 ºC, 190 rpm, indução a D.O.600 nm= 0,6 com 0,5 mM IPTG)e purificação através de centrifugações diferenciais e cromatografia de troca aniónica e filtração em gel. Determinou-se a massa molecular da proteína por filtração em gel (48kDa) e gel de SDS-PAGE (42,48 kDa) e o coeficiente de extinção molar (ε280 nm= 27 900 M-1cm-1), por espetroscopia de UV-Visível. Os resultados obtidos por dispersão de luz permitem concluir que, à semelhança da MreB de outras bactérias, também a de M.hydrocarbonoclasticustem a capacidade de polimerizar, sendo esta reação dependente da concentração de proteína e de KCl, ocorrendo apenas na presença de nucleótidos, com uma concentração crítica semelhante à MreB de Thermotoga maritima (≈3 nM). Verificou-se, ainda, que a velocidade de polimerização da MreB se ajusta a uma função sigmoidal descrita por -.Através da espetroscopia de RMN, determinou-se que oATP e GTP interagem de maneira semelhante com a proteína, adotando estes uma conformação tal que se ligam através da pentose e do grupo–NH2do anel de pirimidina; já o CTP ligar-se-á apenas através da pentose.