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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10362/8300

Title: Desenvolvimento de Primer universal de SBE para codificação espectral de SNP
Authors: Cordeiro, Mílton Jorge Santos
Advisor: Giestas, Letícia
Baptista, Pedro
Keywords: SNP
SBE
FRET
Primer universal
Codificação espectral
Issue Date: 2012
Publisher: Faculdade de Ciências e Tecnologia
Abstract: Na presente dissertação é apresentado o desenvolvimento de um primer universal para codificação espectral de SNP. A utilização deste primer universal permite que o mesmo oligonucleótido marcado com um doador (D1) possa ser utilizado na análise de múltiplos SNPs de forma universal. Para o desenvolvimento deste primer universal foi necessário verificar se o doador utilizado e os aceitantes (que marcam os ddNTPs) permitiam a obtenção de sinais de FRET que identificassem o par doador/aceitante formado (e com isso a confirmação da reacção de extensão de uma só base (SBE)). Para tal utilizou-se D1 como primer de SBE e verificou-se que este sistema permitiu a identificação do par doador/aceitante, em reacções que continham 1 ddNTP e 2 ddNTPs. Não foi possível, no entanto, discriminar a incorporação de 1 ddNTP aquando da presença dos 4 ddNTPs. No seguimento, desenvolveu-se o primer universal para codificação espectral. Nesta abordagem, é utilizado um primer que contém, simultaneamente, a sequência complementar à sequência adjacente ao SNP que se pretende detectar e a sequência complementar a D1. Desta forma, após uma reacção de extensão de uma só base, a hibridação entre D1 e o primer universal leva à aproximação entre o doador e o aceitante incorporado, permitindo que ocorra transferência de energia entre ambos. A análise espectral dos produtos de reacção permitiu a identificação do ddNTP incorporado no primer universal, e desta forma, a identificação do nucleótido que ocupa a posição a ser analisada. Foram avaliadas as respostas deste sistema para as seguintes condições: 1 template e 1 ddNTP, 1 template e 2 ddNTPs, 2 templates e 2 ddNTPs, 1 template e 4 ddNTPs. Foi possível detectar o par doador/aceitante nas reacções que continham 1 ddNTP e 1 template. Foi também identificado o par doador/aceitante nas situações que mimetizam genótipos homozigótos (1 template e dois ddNTPs) e genótipos heterozigótos (2 templates e 2 ddNTPs). No entanto, não foi possível a identificação do par doador/aceitante nas reacções que continham os 4 ddNTPs . Este sistema foi aplicado em 6 amostras biológicas contendo um SNP que está envolvido na predisposição ao desenvolvimento de obesidade, cujo genótipo foi confirmado por sequenciação. Das 6 amostras testadas, o sistema desenvolvido identificou correctamente 4 genótipos. Apesar de necessitar de uma optimização mais extensa, o sistema de primer universal desenvolvido durante esta dissertação permite a identificação de diferentes SNPs, utilizando o mesmo oligonucleótido marcado com o doador.
Description: Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10362/8300
Appears in Collections:FCT: DCV - Dissertações de Mestrado

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