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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10362/8135

Title: Localização de mRNA em Drosophila melanogaster: estudo da proteína Ypsilon Schachtel
Authors: Nabais, Joana Raquel
Advisor: Trincão, José
Issue Date: 2010
Publisher: Faculdade de Ciências e Tecnologia
Abstract: Pretendeu-se com este trabalho, a clonagem do gene ypsilon schachtel (yps) e a consequente expressão e purificação da respectiva proteína para posterior resolução da estrutura tridimensional, pela técnica de cristalografia de raios-X. A proteína yps pertence à família das proteínas Y-box, conhecida pela capacidade de ligação ao elemento Y-box do DNA. Recentemente, constatou-se que a yps faz parte de um complexo ribonucleoproteico envolvido na localização de mRNA nas regiões anterior e posterior do oócito de Drosophila melanogaster. Aparenta ter um papel activo e abrangente neste processo, desconhecendo-se ainda os mecanismos através dos quais o desempenha. A resolução da estrutura tridimensional da proteína, permitiria a análise do seu arranjo e reconhecimento de regiões que poderão estar envolvidas nas hipotéticas interacções entre a proteína e o complexo que constitui, e/ou entre a proteína e o mRNA que é transportado. Atendendo essencialmente ao tamanho da proteína, a cristalografia de raios-X apresenta-se como o melhor método para o estudo pretendido. Para tal, é necessário proceder-se à clonagem do cDNA do gene yps em vector apropriado; sobre-expressar, isolar, purificar e cristalizar a proteína nele codificada. Em estudos anteriores, verificou-se que o grau de ordem de uma proteína afecta directamente o seu processo de cristalização: proteínas mais ordenadas constituem cristais mais ordenados e consequentemente, obtêm-se conjuntos de dados de melhor resolução. Assim, recorreu-se a diversas ferramentas bioinformáticas disponíveis com o intuito de se antever a globularidade da proteína yps. Verificou-se que se prevê alguma ordem apenas nos primeiros 121 aminoácidos e, deste modo, esta região constitui o objecto de estudo do trabalho aqui exposto. Esta tese, contempla o estudo desde a clonagem do gene yps à purificação da proteína yps. Amplificaram-se dois fragmentos distintos da região globular mencionada, e ensaiou-se a sua clonagem em três vectores de clonagem e expressão: pGEX-6P1, pET-14b e pET-15b. Apenas com este último, a clonagem foi bem-sucedida. Transformou-se o vector recombinante em células competentes apropriadas e expressou-se a proteína em Escherichia coli, pelos métodos de indução e auto-indução. Por fim, a proteína alvo foi isolada e purificada por cromatografia de afinidade com metal imobilizado.
Description: Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia
URI: http://hdl.handle.net/10362/8135
Appears in Collections:FCT: DCV - Dissertações de Mestrado

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