Isolamento e caracterização de enzimas multihémicas de origem microbiana e sua aplicação no desenvolvimento de biossensores

Abstract

O trabalho apresentado na presente dissertação, tem por tema central, a construção de biossensores enzimáticos e electroquímicos específicos para nitrito e sulfito baseados, respectivamente, nas redutases do nitrito (cd1NiR de Marinobacter hydrocarbonoclasticus), e do sulfito (desulfoviridina de Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774), como elementos de reconhecimento biológico. Apesar da estrutura cristalográfica da cd1NiR não ter sido conseguida, a análise da sequência de resíduos de aminoácidos e a simulação da respectiva estrutura tridimensional indicam uma elevada semelhança estrutural com a enzima de Pseudomonas aeruginosa. Por espectroscopia de ressonância Raman, comprovou-se o número de coordenação, o estado de spin e o potencial formal dos dois co-factores, com a identificação parcial dos modos vibracionais de hemo d1. Foi construído um biossensor amperométrico para nitritos através da co-imobilização da cd1NiR e do seu parceiro fisiológico, o citocromo-c552, que funcionou como mediador electrónico. A utilização de eléctrodos screen printed como plataforma de transdução conferiu ao sistema simplicidade operacional e portabilidade. A adsorção da cd1NiR numa superfície de Au modificado com monocamadas automontadas permitiu alcançar pela primeira vez, usando a técnica de voltametria cíclica, uma resposta electroquímica directa da proteína. A reacção de redução envolve a transferência de um electrão e de um protão, e é seguida de uma alteração estrutural. O processo anódico, quando visualizado, não deverá representar a reacção inversa. Nas condições testadas, não foi detectada actividade catalítica na presença de nitrito. A desulfoviridina apresenta-se na forma de um complexo heteromérico, numa configuração 2 2 2. Com base na estrutura primária determinada, simulou-se a estrutura tridimensional da proteína. Foram quantificados 17 átomos de Fe por complexo proteico, dados que contrastam com os reportados para a proteína de D. vulgaris, e que podem estar na génese da ausência de actividade catalítica verificada no decurso dos ensaios electroquímicos, a qual impossibilitou o desenvolvimento de um biossensor com recurso a esta enzima.