Au-nanossondas aplicação na detecção de Mycobacterium tuberculosis e plasmodium berghei

Abstract

A presente tese apresenta a caracterização de um sistema de Nanossondas de Ouro quanto à sua estabilidade, sensibilidade e especificidade, na detecção de alvos de DNA em amostras controlo e biológicas. Foram analisados factores envolvidos na modelação das propriedades deste sistema, nomeadamente a extensão de funcionalização, o tamanho da sequência dos oligonucleótidos sonda, entre outros. Foram desenvolvidas duas sondas: PlasmBerg e MTub, específicas para Plasmodium berghei e Mycobacterium tuberculosis,respectivamente. O sistema obtido permite a quantificação semi-quantitativa de DNA,com limites de detecção de 13 μg/mL e de 20 μg/mL para as sondas PlasmBerg e MTub respectivamente. Este sistema demonstrou um elevado nível de especificidade,possibilitando a diferenciação entre alvos totalmente complementares de alvos com mismatch. Optimizou-se o sistema de Au-nanossondas para a detecção de mutações pontuais presentes nos codões 516 e 531 do gene rpoB de M. tuberculosis, associados à resistência a antibióticos. Verificou-se que o sistema discrimina entre sequências complementares e sequências com mutações pontuais, possibilitando também a discriminação entre M. tuberculosis e M. kansasii. Validou-se o sistema desenvolvido com a sonda MTub recorrendo a 144 amostras biológicas previamente analisadas por quatro métodos padrão. Verificou-se que apenas 1,2% (1/83) dos resultados Negativo não apresentam qualquer correlação com os testes padrão.