Estudos estruturais e funcionais da fenilalanina hidroxilase humana

Abstract

A fenilalanina hidroxilase humana (hPAH) é uma enzima dependente de ferro não-hémico que catalisa a hidroxilação do aminoácido aromático essencial fenilalanina (L-Phe) a tirosina, na presença do cofactor pterínico tetrahidrobiopterina e do oxigénio molecular. Esta enzima faz parte da via metabólica de degradação catabólica da L-Phe proveniente da dieta e é responsável por 75% da sua utilização. A hPAH assume particular importância na saúde humana uma vez que uma deficiente actividade ou expressão proteica, como consequência de mutações no gene que a codifica, é responsável pela doença hereditária conhecida como fenilcetonúria (PKU), a doença mais frequente no metabolismo dos aminoácidos e que apresenta uma incidência na população Caucasiana de 1:10000. O tratamento universalmente aceite e aconselhado consiste numa restrição dietética da L-Phe, o qual deve ser instaurado logo após o nascimento, de modo a evitar o atraso mental severo. No entanto, e devido à dificuldade em aderir ao tratamento dietético novas abordagens terapêuticas, menos restritivas, estão em estudo, nomeadamente a terapia enzimática de reposição. Presentemente, são apenas conhecidas as estruturas cristalinas de formas truncadas da PAH humana e de rato, as quais têm contribuído significativamente para a elucidação do mecanismo catalítico da PAH e para a identificação das bases moleculares da PKU. No entanto, e em parte devido à instabilidade da hPAH, ainda não foi obtida a estrutura tri-dimensional da forma intacta. Neste trabalho, com o objectivo de obter a estrutura completa da hPAH, expressaram-se e purificaram-se duas proteínas quiméricas variantes, hPAH C29S e hPAH E360K, uma vez que apresentam um nível de expressão superior ao da forma selvagem (hPAHwt) o que sugere uma maior estabilidade proteica. A existência destas formas mutantes permitiu ter material de partida para os ensaios de cristalização e estudos de difracção de raios-X. Foram obtidas condições de cristalização para ambos os mutantes que originaram resultados preliminares promissores, importantes para a determinação da estrutura tri-dimensional da forma intacta da hPAH. Procedeu-se ainda à caracterização enzimática das proteínas quiméricas. Curiosamente, apenas a hPAH C29S apresentou um aumento da velocidade máxima da reação (Vmax) e da temperatura de desnaturação (Tm), relativamente à hPAHwt. O conhecimento da estrutura 3D será fundamental para a identificação dos determinantes moleculares dos fenótipos PKU e para uma melhor compreensão do mecanismo catalítico. Adicionalmente, a proteína quimérica C29S mostrou ser uma forte candidata para formulação e utilização no tratamento da PKU por terapia enzimática de reposição.